БИОХИМИЯ, 2019, том 84, вып. 1, с. 85–99
УДК 577.112
Варианты синтезированного в Escherichia coli рекомбинантного эритропоэтина человека: влияние дополнительных доменов на активность in vitro и in vivo*
1 Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России, 123098 Москва, Россия; электронная почта: akaryagina@gmail.com, alexander.v.gromov@gmail.com
2 Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии, 127550 Москва, Россия
3 НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Россия
4 Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, НИЦ «Курчатовский институт», 117545 Москва, Россия
5 Научный центр психического здоровья, 115522 Москва, Россия
Поступила в редакцию 10.07.2018
После доработки 14.09.2018
Принята к публикации 14.09.2018
DOI: 10.1134/S032097251901007X
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: эритропоэтин, гепарин-связывающий домен, пролиферация клеток эритролейкемии человека TF-1, васкуляризация тканей.
Аннотация
Целью работы являлась сравнительная характеристика трех вариантов синтезированного в клетках Escherichia coli рекомбинантного эритропоэтина человека с дополнительными белковыми доменами: белка 6His-s-tag-EPO, несущего на N-конце s-tag — 15-звенный олигопептид из рибонуклеазы А поджелудочной железы быка, и белков HBD-EPO и EPO-HBD, содержащих, соответственно, в N– и C-концевых положениях дополнительный гепарин-связывающий домен (HBD) из костного морфогенетического белка BMP-2 Danio rerio. В качестве препарата сравнения был использован коммерческий препарат эпостим (ООО «Фарма-парк», Россия), полученный синтезом в клетках яичников китайского хомячка. Белок EPO-HBD — вариант синтезированного в E. coli рекомбинантного эритропоэтина c доменом HBD на C-конце, присоединенный к эритропоэтиновому домену жестким междоменным спейсером, — имеет лучшие характеристики по сравнению с белком HBD-EPO c обратной последовательностью соединения доменов. Белок EPO-HBD обладает повышенной в ~13 раз биологической активностью in vitro, заключающейся в способности вызывать пролиферацию клеток эритролейкемии человека TF-1, большей скоростью ассоциации с рецептором эритропоэтина EPOR, а также лучшими среди четырех исследованных белков параметрами связывания и пролонгированного выхода из носителя — деминерализованного костного матрикса (ДКМ). При подкожном введении EPO-HBD, иммобилизованного на ДКМ, наблюдается существенно более выраженная васкуляризация окружающих тканей, чем при введении ДКМ с другими белками и ДКМ без нанесенного белка. Таким образом, по всем изученным параметрам белок EPO-HBD обладает лучшими характеристиками в сравнении с другими исследованными вариантами EPO, и представляется перспективным изучение возможности его медицинского применения.
Текст статьи
Сноски
* Первоначально английский вариант рукописи опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow) http://protein.bio.msu.ru/biokhimiya, в рубрике «Papers in Press», BM18-197, 12.11.2018.
** Адресат для корреспонденции.
Финансирование
Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ (грант № 16-15-00133).
Благодарности
Авторы выражают благодарность З.М. Галушкиной за выращивание биомассы для выделения белка и М.С. Кривозубову за помощь в подготовке дисков из ДКМ.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Соблюдение этических норм
Все процедуры, выполненные в исследованиях с участием животных, соответствовали этическим стандартам, утвержденным «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» в НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России, где проводились исследования, положениям Директивы 2010/63/EU и Приложению А к Европейской Конвенции ETS № 123.
Список литературы
1. Krantz, S.B. (1991) Erythropoietin, Blood, 77, 419–434.
2. Shiozawa, Y., Jung, Y., Ziegler, A.M., Pedersen, E.A., Wang, J., Wang, Z., Song, J., Wang, J., Lee, C.H., Sud, S., Pienta, K.J., Krebsbach, P.H., and Taichman, R.S. (2010) Erythropoietin couples hematopoiesis with bone formation, PLoS One, 5, e10853.
3. Wu, C., Giaccia, A.J., and Rankin, E.B. (2014) Osteoblasts: a novel source of erythropoietin, Curr. Osteoporos. Rep., 4, 428–432.
4. Li, C., Shi, C., Kim, J., Chen, Y., Ni, S., Jiang, L., Zheng, C., Li, D., Hou, J., Taichman, R.S., and Sun, H. (2015) Erythropoietin promotes bone formation through EphrinB2/EphB4 signaling, J. Dent. Res., 94, 455–463.
5. Holstein, J.H., Menger, M.D., Scheuer, C., Meier, C., Culemann, U., Wirbel, R.J., Garcia, P., and Pohlemann, T. (2007) Erythropoietin (EPO): EPO-receptor signaling improves early endochondral ossification and mechanical strength in fracture healing, Life Sci., 80, 893–900.
6. Holstein, J.H., Orth, M., Scheuer, C., Tami, A., Becker, S.C., Garcia, P., Histing, T., Morsdorf, P., Klein, M., Pohlemann, T., and Menger, M.D. (2011) Erythropoietin stimulates bone formation, cell proliferation, and angiogenesis in a femoral segmental defect model in mice, Bone, 49, 1037–1045.
7. Garcia, P., Speidel, V., Scheuer, C., Laschke, M.W., Holstein, J.H., Histing, T., Pohlemann, T., and Menger, M.D. (2011) Low dose erythropoietin stimulates bone healing in mice, J. Orthop. Res., 29, 165–172.
8. Rolfing, J.H.D., Bendtsen, M., Jensen, J., Stiehler, M., Foldager, C.B., Hellfritzsch, M.B., and Bunger, C. (2012) Erythropoietin augments bone formation in a rabbit posterolateral spinal fusion model, J. Orthop. Res., 30, 1083–1088.
9. Sun, H., Jung, Y., Shiozawa, Y., Taichman, R.S., and Krebsbach, P.H. (2012) Erythropoietin modulates the structure of bone morphogenetic protein 2-engineered cranial bone, Tissue Eng. Part A, 18, 2095–20105.
10. Rolfing, J.H., Jensen, J., Jensen, J.N., Greve, A.S., Lysdahl, H., Chen, M., Rejnmark, L., and Bunger, C. (2014) A single topical dose of erythropoietin applied on a collagen carrier enhances calvarial bone healing in pigs, Acta Orthop., 85, 201–209.
11. Patel, J.J., Modes, J.E., Flanagan, C.L., and Krebsbach, P.H. (2015) Dual delivery of EPO and BMP2 from a novel modular poly-ε-caprolactone construct to increase the bone formation in prefabricated bone flaps, Tissue Eng. Part C Methods, 21, 889–897.
12. Omlor, G.W., Kleinschmidt, K., Gantz, S., Speicher, A., Guehring, T., and Richter, W. (2016) Increased bone formation in a rabbit long-bone defect model after single local and single systemic application of erythropoietin, Acta Orthop., 87, 425–431.
13. Wang, Y.J., Liu, Y.D., Chen, J., Hao, S.J., Hu, T., Ma, G.H., and Su, Z.G. (2010) Efficient preparation and PEGylation of recombinant human non-glycosylated erythropoietin expressed as inclusion body in E. coli, Int. J. Pharm., 386, 156–164.
14. Jeong, T.H., Son, Y.J., Ryu, H.B., Koo, B.K., Jeong, S.M., Hoang, P., Do, B.H., Song, J.A., Chong, S.H., Robinson, R.C., and Choe, H. (2014) Soluble expression and partial purification of recombinant human erythropoietin from E. coli, Protein Expr. Purif., 95, 211–218.
15. Boissel, J.P., Lee, W.R., Presnell, S.R., Cohen, F.E., and Bunn, H.F. (1993) Erythropoietin structure-function relationships. Mutant proteins that test a model of tertiary structure, J. Biol. Chem., 268, 5983–5993.
16. Narhi, L.O., Arakawa, T., Aoki, K., Wen, J., Elliott, S., Boone, T., and Cheetham, J. (2001) Asn to Lys mutations at three sites which are N-glycosylated in the mammalian protein decrease the aggregation of Escherichia coli-derived erythropoietin, Protein Eng., 14, 135–140.
17. Grunina, T.M., Demidenko, A.V., Lyaschuk, A.M., Poponova, M.S., Galushkina, Z.M., Soboleva, L.A., Cherepushkin, S.A., Polyakov, N.B., Grumov, D.A., Solovyev, A.I., Zhukhovitsky, V.G., Boksha, I.S., Subbotina, M.E., Gromov, A.V., Lunin, V.G., and Karyagina, A.S. (2017) Recombinant human erythropoietin with additional processable protein domains: purification of protein synthesized in Escherichia coli heterologous expression system, Biochemistry (Moscow), 82, 1285–1294.
18. Karyagina, A.S., Grunina, T.M., Poponova, M.S., Orlova, P.A., Manskikh, V.N., Demidenko, A.V., Strukova, N.V., Manukhina, M.S., Lyaschuk, A.M., Galushkina, Z.M., Cherepushkin, S.A., Polyakov, N.B., Solovyev, A.I., Zhukhovitsky, V.G., Tretyak, D.A., Boksha, I.S., Gromov, A.V., and Lunin, V.G. (2018) Synthesis in Escherichia coli and characterization of human recombinant erythropoietin with additional heparin-binding domain, Biochemistry (Moscow), 83, 1207–1221.
19. McCullough, P.A., Barnhart, H.X., Inrig, J.K., Reddan, D., Sapp, S., Patel, U.D., Singh A.K., Szczech, L.A., and Califf, R.M. (2013) Cardiovascular toxicity of epoetin-alfa in patients with chronic kidney disease, Am. J. Nephrol., 37, 549–558.
20. Douros, A., Jobski, K., Kollhorst, B., Schink, T., and Garbe, E. (2016) Risk of venous thromboembolism in cancer patients treated with epoetins or blood transfusions, Br. J. Clin. Pharmacol., 82, 839–848.
21. Ruppert, R., Hoffmann, E., and Sebald, W. (1996) Human bone morphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site, which modifies its biological activity, Eur. J. Biochem., 37, 295–302.
22. Karyagina, A.S., Boksha, I.S., Grunina, T.M., Demidenko, A.V., Poponova, M.S., Sergienko, O.V., Lyaschuk, A.M., Galushkina, Z.M., Soboleva, L.A., Osidak, E.O., Semikhin, A.S., Gromov, A.V., and Lunin, V.G. (2016) Optimization of rhBMP-2 active-form production in a heterologous expression system using microbiological and molecular genetic approaches, Mol. Genet. Microbiol. Virol., 31, 208–213.
23. Bartov, M.S., Gromov, A.V., Poponova, M.S., Savina, D.M., Nikitin, K.E., Grunina, T.M., Manskikh, V.N., Gra, O.A., Lunin, V.G., Karyagina, A.S., and Gintsburg, A.L. (2016) Modern approaches to research of new osteogenic biomaterials on the model of regeneration of cranial critical-sized defects in rats, Bull. Exp. Biol. Med., 162, 273–276.
24. Chen, X., Zaro, J.L., and Shen, W.C. (2013) Fusion protein linkers: property, design and functionality, Adv. Drug. Deliv. Rev., 65, 1357–1369.
25. Brines, M., Grasso, G., Fiordaliso, F., Sfacteria, A., Ghezzi, P., Fratelli, M., Latini, R., Xie, Q.W., Smart, J., Su-Rick, C.J., Pobre, E., Diaz, D., Gomez, D., Hand, C., Coleman, T., and Cerami, A. (2004) Erythropoietin mediates tissue protection through an erythropoietin and common beta-subunit heteroreceptor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 14907–14912.
26. Rolfing, J., Baatrup, A., Stiehler, M., Jensen, J., Lysdahl, H., and Bunger, C. (2014) The osteogenic effect of erythropoietin on human mesenchymal stromal cells is dose-dependent and involves non-hematopoietic receptors and multiple intracellular signaling pathways, Stem Cell Rev., 10, 69–78.
27. Kim, J., Jung, Y., Sun, H., Joseph, J., Mishra, A., Shiozawa, Y., Wang, J., Krebsbach, P.H., and Taichman, R.S. (2012) Erythropoietin mediated bone formation is regulated by mTOR signaling, J. Cell Biochem., 113, 220–228.
28. Garcia, P., Speidel, V., Scheuer, C., Laschke, M.W., Holstein, J.H., Histing, T., Pohlemann, T., and Menger, M.D. (2011) Low dose erythropoietin stimulates bone healing in mice, J. Orthop. Res., 29, 165–172.
29. Holstein, J.H., Orth, M., Scheuer, C., Tami, A., Becker, S.C., Garcia, P., Histing, T., Morsdorf, P., Klein, M., Pohlemann, T., and Menger, M.D. (2011) Erythropoietin stimulates bone formation, cell proliferation, and angiogenesis in a femoral segmental defect model in mice, Bone, 49, 1037–1045.
30. Li, C., Shi, C., Kim, J., Chen, Y., Ni, S., Jiang, L., Zheng, C., Li, D., Hou, J., Taichman, R.S., and Sun, H. (2015) Erythropoietin promotes bone formation through EphrinB2/EphB4 signaling, J. Dent. Res., 94, 455–463.
31. Karyagina, A.S., Boksha, I.S., Grunina, T.M., Demidenko, A.V., Poponova, M.S., Sergienko, O.V., Lyashchuk, A.M., Galushkina, Z.M., Soboleva, L.A., Osidak, E.O., Bartov, M.S., Gromov, A.V., and Lunin, V.G. (2017) Two variants of recombinant human bone morphogenetic protein 2 (rhBMP-2) with additional protein domains: synthesis in an Escherichia coli heterologous expression system, Biochemistry (Moscow), 82, 613–624.
32. Concepcion, J., Witte, K., Wartchow, C., Choo, S., Yao, D., Persson, H., Wei, J., Li, P., Heidecker, B., Ma, W., Varma, R., Zhao, L.-S., Perillat, D., Carricato, G., Recknor, M., Du, K., Ho, H., Ellis, T., Gamez, J., Howes, M., Phi-Wilson, J., Lockard, S., Zuk, R., and Tan, H. (2009) Label-free detection of biomolecular interactions using BioLayer interferometry for kinetic characterization, Comb. Chem. High Throughput Screen., 12, 791–800.
33. Громов А.В., Никитин К.Е., Карпова Т.А., Зайцев В.В., Сидорова Е.И., Андреева Е.В., Бартов М.С., Мишина Д.М., Субботина М.Е., Шевлягина Н.В., Сергиенков М.А., Соболева Л.А., Котнова А.П., Шарапова Н.Е., Семихин А.С., Диденко Л.В., Карягина А.С., Лунин В.Г. (2012) Разработка методики получения остеопластического материала на основе деминерализованного костного матрикса с максимальным содержанием нативных факторов роста костной ткани, Биотехнология, 5, 66–75.
34. Heidenhain, M. (1905) Zeitschrift fur wissenschaftliche Mikroskopie und fur mikroskopische Technik, S. Hirzel, Leipzig, 22, pp. 339.
35. Zwingenberger, S., Langanke, R., Vater, C., Lee, G., Niederlohmann, E., Sensenschmidt, M., Jacobi, A., Bernhardt, R., Muders, M., Rammelt, S., Knaack, S., Gelinsky, M., Gunther, K.P., Goodman, S.B., and Stiehler, M. (2016) The effect of SDF-1б on low dose BMP-2 mediated bone regeneration by release from heparinized mineralized collagen type I matrix scaffolds in a murine critical size bone defect model, J. Biomed Mater. Res. A, 104, 2126–2134.
36. Hwang, C.J., Vaccaro, A.R., Lawrence, J.P., Hong, J., Schellekens, H., Alaoui Ismaili, M.H., and Falb, D. (2009) Immunogenicity of bone morphogenetic proteins, J. Neuro-surg. Spine, 10, 443–451.