БИОХИМИЯ, 2019, том 84, вып. 1, с. 74–84
УДК 577.15.08
Метод иммуноблоттинга для количественного измерения уровня фосфорилирования регуляторных легких цепей миозина II в небольших количествах немышечных клеток*
1 Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии, 121552 Москва, Россия; электронный адрес: askerkhapcha@gmail.com
2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, факультет фундаментальной медицины, 119192 Москва, Россия
3 Первый московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова, 119991 Москва, Россия
Поступила в редакцию 06.07.2018
После доработки 10.09.2018
Принята к публикации 10.09.2018
DOI: 10.1134/S0320972519010068
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: регуляторные легкие цепи миозина, немышечные клетки, фосфорилирование, иммуноблоттинг, количественное измерение.
Аннотация
Миозин II типа — основной молекулярный мотор для осуществления актомиозин-зависимых двигательных процессов в клетках. Фосфорилирование регуляторных легких цепей (РЛЦ) миозина по остатку Ser-19 является необходимым условием для активации гладкомышечного/немышечного миозина II и служит биохимическим эквивалентом их активности. Дополнительное фосфорилирование РЛЦ по Thr-18 повышает АТP-азную активность миозина II. Для измерения уровня фосфорилирования РЛЦ миозина по Ser-19 или дифосфорилирования по Thr-18/Ser-19 существует ряд методов, эффективных и надежных при измерениях в богатых миозином тканях. Однако для немышечных клеток, которые характеризуются низким содержанием миозина II и обычно доступны для исследований в существенно меньших количествах, применение этих методов ограничено. В этой связи анализ динамики изменения фосфорилирования РЛЦ в многочисленных образцах немышечных клеток становится серьезной задачей, требующей большого количества клеток. Использование фосфоспецифичных антител повышает чувствительность измерений, но позволяет определить только относительные уровни фосфорилирования РЛЦ по индивидуальным остаткам. Следовательно, сложно говорить о физиологической значимости наблюдаемых изменений. С целью количественного измерения уровня фосфорилирования РЛЦ в небольших количествах немышечных клеток мы использовали калибровочные стандартные нефосфорилированные и фосфорилированные in vitro РЛЦ в иммуноблоттинге с фосфоспецифическими антителами против РЛЦ после классического электрофореза. В настоящей работе приведено подробное описание данного метода и продемонстрировано его применение для количественного измерения изменений уровня фосфорилирования РЛЦ в эндотелиальных клетках человека в ответ на природные агонисты, тромбин и инсулин, а также содержания фосфорилированных РЛЦ в тромбоцитах человека. Обсуждены преимущества и ограничения описываемого метода в сравнении с другими методами измерения уровня фосфорилирования РЛЦ в немышечных клетках.
Текст статьи
Сноски
* Первоначально английский вариант рукописи опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow) http://protein.bio.msu.ru/biokhimiya, в рубрике «Papers in Press», BM18-193, 08.10.2018.
** Адресат для корреспонденции.
Финансирование
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 14-04-32039; разработка и валидация описываемого метода) и РНФ (грант № 14-35-00026; работы по количественной оценке действия тромбина и инсулина).
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Соблюдение этических норм
Все процедуры, выполненные в исследовании с участием людей, соответствуют этическим стандартам институционального и/или национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 г. и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики. От каждого из включенных в исследование участников было получено информированное добровольное согласие.
Список литературы
1. Betapudi, V. (2014) Life without double-headed non-muscle myosin II motor proteins, Front. Chem., 2, 45.
2. Heissler, S.M., and Sellers, J.R. (2016) Various themes of myosin regulation, J. Mol. Biol., 428, 1927–1946.
3. Heissler, S.M., and Manstein, D.J. (2013) Nonmuscle myosin-2: mix and match, Cell. Mol. Life Sci., 70, 1–21.
4. Matsumura, F., Yamakita, Y., and Yamashiro, S. (2011) Myosin light chain kinases and phosphatase in mitosis and cytokinesis, Arch. Biochem. Biophys., 510, 76–82.
5. Khapchaev, A.Y., and Shirinsky, V.P. (2016) Myosin light chain kinase MYLK1: anatomy, interactions, functions, and regulation, Biochemistry (Moscow), 81, 1676–1697.
6. Amano, M., Ito, M., Kimura, K., Fukata, Y., Chihara, K., Nakano, T., Matsuura, Y., and Kaibuchi, K. (1996) Phosphorylation and activation of myosin by Rho-associated kinase (Rho-kinase), J. Biol. Chem., 271, 20246–20249.
7. Amano, M., Nakayama, M., and Kaibuchi, K. (2010) Rho-Kinase/ROCK: A key regulator of the cytoskeleton and cell polarity, Cytoskeleton, 67, 545–554.
8. Kimura, K., Ito, M., Amano, M., Chihara, K., Fukata, Y., Nakafuku, M., Yamamori, B., Feng, J.H., Nakano, T., Okawa, K., Iwamatsu, A., and Kaibuchi, K. (1996) Regulation of myosin phosphatase by Rho and Rho-associated kinase (Rho-kinase), Science, 273, 245–248.
9. Silver, P. J., and Stull, J. T. (1982) Quantitation of myosin light chain phosphorylation in small tissue samples, J. Biol. Chem., 257, 6137–6144.
10. Persechini, A., Kamm, K. E., and Stull, J. T. (1986) Different phosphorylated forms of myosin in contracting tracheal smooth-muscle, J. Biol. Chem., 261, 6293–6299.
11. Hirano, M., and Hirano, K. (2016) Myosin di-phosphorylation and peripheral actin bundle formation as initial events during endothelial barrier disruption, Sci. Rep., 6, 20989.
12. Puetz, S., Schroeter, M.M., Piechura, H., Reimann, L., Hunger, M.S., Lubomirov, L.T., Metzler, D., Warscheid, B., and Pfitzer, G. (2012) New insights into myosin phosphorylation during cyclic nucleotide-mediated smooth muscle relaxation, J. Muscle Res. Cell Motil., 33, 471–483.
13. Aguilar, H.N., Tracey, C.N., Tsang, S.C.F., McGinnis, J.M., and Mitchell, B.F. (2011) Phos-tag-based analysis of myosin regulatory light chain phosphorylation in human uterine myocytes, PLoS One, 6, e20903.
14. Takeya, K., Loutzenhiser, K., Shiraishi, M., Loutzenhiser, R., and Walsh, M.P. (2008) A highly sensitive technique to measure myosin regulatory light chain phosphorylation: the first quantification in renal arterioles, Am. J. Physiol. Renal., 294, F1487–F1492.
15. Taylor, S.C., Berkelman, T., Yadav, G., and Hammond, M. (2013) A defined methodology for reliable quantification of Western blot data, Mol. Biotechnol., 55, 217–226.
16. Taylor, S.C., and Posch, A. (2014) The design of a quantitative Western blot experiment, Biomed. Res. Int., 2014, 361590.
17. Siller-Matula, J.M., Schwameis, M., Blann, A., Mannhalter, C., and Jilma, B. (2011) Thrombin as a multi-functional enzyme: focus on in vitro and in vivo effects, Thromb. Haemostasis., 106, 1020–1033.
18. Liu, Y., Chen, X.L., Wang, L., and Martins-Green, M. (2017) Insulin antagonizes thrombin-induced microvessel leakage, J. Vasc. Res., 54, 143–155.
19. Gopalakrishna, R., and Anderson, W.B. (1982) Ca2+-induced hydrophobic site on calmodulin – application for purification of calmodulin by phenyl-Sepharose affinity-chromatography, Biochem. Biophys. Res. Commun., 104, 830–836.
20. Adelstein, R.S., and Klee, C.B. (1981) Purification and characterization of smooth-muscle myosin light chain kinase, J. Biol. Chem., 256, 7501–7509.
21. Bradford, M.M. (1976) Rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing principle of protein-dye binding, Anal. Biochem., 72, 248–254.
22. Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 227, 680–685.
23. Towbin, H., Staehelin, T., and Gordon, J. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets – procedure and some applications, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4350–4354.
24. Yeung, Y.G., and Stanley, E.R. (2009) A solution for stripping antibodies from polyvinylidene fluoride immunoblots for multiple reprobing, Anal. Biochem., 389, 89–91.
25. Ikebe, M., Hartshorne, D.J., and Elzinga, M. (1986) Identification, phosphorylation, and dephosphorylation of a 2nd site for myosin light chain kinase on the 20,000-dalton light chain of smooth-muscle myosin, J. Biol. Chem., 261, 36–39.
26. Daniel, J.L., Molish, I.R., and Holmsen, H. (1981) Myosin phosphorylation in intact platelets, J. Biol. Chem., 256, 7510–7514.
27. Somlyo, A.P., and Somlyo, A.V. (2003) Ca2+ sensitivity of smooth muscle and nonmuscle myosin II: modulated by G proteins, kinases, and myosin phosphatase, Physiol. Rev., 83, 1325–1358.
28. Walsh, M.P. (2011) Vascular smooth muscle myosin light chain diphosphorylation: mechanism, function, and pathological implications, IUBMB Life, 63, 987–1000.
29. Takeya, K., Wang, X., Sutherland, C., Kathol, I., Loutzenhiser, K., Loutzenhiser, R.D., and Walsh, M.P. (2014) The involvement of myosin regulatory light chain diphosphorylation in sustained vasoconstriction under pathophysiological conditions, J. Smooth Muscle Res., 50, 18–28.
30. Sandquist, J.C., Swenson, K.I., DeMali, K.A., Burridge, K., and Means, A.R. (2006) Rho kinase differentially regulates phosphorylation of nonmuscle myosin II isoforms A and B during cell rounding and migration, J. Biol. Chem., 281, 35873–35883.
31. Colburn, J.C., Michnoff, C.H., Hsu, L.C., Slaughter, C.A., Kamm, K.E., and Stull, J.T. (1988) Sites phosphorylated in myosin light chain in contracting smooth-muscle, J. Biol. Chem., 263, 19166–19173.
32. Kamm, K.E., Hsu, L.C., Kubota, Y., and Stull, J.T. (1989) Phosphorylation of smooth-muscle myosin heavy and light-chains – effects of phorbol dibutyrate and agonists, J. Biol. Chem., 264, 21223–21229.
33. Garcia, J.G.N., Davis, H.W., and Patterson, C.E. (1995) Regulation of endothelial-cell gap formation and barrier dysfunction – role of myosin light-chain phosphorylation, J. Cell. Physiol., 163, 510–522.
34. Garcia, J.G.N., Verin, A.D., Schaphorst, K., Siddiqui, R., Patterson, C.E., Csortos, C., and Natarajan, V. (1999) Regulation of endothelial cell myosin light chain kinase by Rho, cortactin, and p60(src), Am. J. Physiol., 276, L989–L998.
35. Hornbeck, P.V., Zhang, B., Murray, B., Kornhauser, J.M., Latham, V., and Skrzypek, E. (2015) PhosphoSitePlus, 2014: mutations, PTMs and recalibrations, Nucleic Acids Res., 43, D512–D520.
36. Aguilar, H.N., Zielnik, B., Tracey, C.N., and Mitchell, B.F. (2010) Quantification of rapid myosin regulatory light chain phosphorylation using high-throughput in-cell Western assays: comparison to Western immunoblots, PLoS One, 5, e9965.
37. Vouret-Craviari, V., Boquet, P., Pouyssegur, J., and van Obberghen-Schilling, E. (1998) Regulation of the actin cytoskeleton by thrombin in human endothelial cells: role of Rho proteins in endothelial barrier function, Mol. Biol. Cell, 9, 2639–2653.