БИОХИМИЯ, 2019, том 84, вып. 1, с. 53–62
УДК 577.152.342
Подвижная петля активного центра — недооцененная структурная детерминанта субстратной селективности металлокарбоксипептидаз*,**
1 Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, 117545 Москва, Россия; электронная почта: valery.akparov@yandex.ru
2 Институт кристаллографии им. А.В. Шубникова ФНИЦ «Кристаллография и фотоника» РАН, 119333 Москва, Россия; электронная почта: tostars@mail.ru
3 НИЦ «Курчатовский институт», 123182 Москва, Россия; электронная почта: taniarakitina@yahoo.com
4 Московский физико-технический институт (государственный университет), 141700, Московская область, Долгопрудный, Россия; электронная почта: khig@mail.ru
5 Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, Россия; электронная почта: taniarakitina@yahoo.com
6 Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Россия; электронная почта: vytas@belozersky.msu.ru
Поступила в редакцию 05.06.2018
После доработки 19.09.2018
Принята к публикации 19.09.2018
DOI: 10.1134/S0320972519010044
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: металлокарбоксипептидаза Т, Thermoactinomyces vulgaris, металлокарбоксипептидаза В, S1'-субсайт, субстратная специфичность, N-сульфамоил-L-фенилаланин, рентгеноструктурный анализ.
Аннотация
Принято считать, что первичную субстратную специфичность металлокарбоксипептидаз определяет строение кармана первичной специфичности. Однако мутант карбоксипептидазы Т из Thermoactinomyces vulgaris, в котором, благодаря заменам G215S, A251G, T257A, D260G, T262D, был полностью воспроизведен карман первичной специфичности панкреатической карбоксипептидазы В, сохранил присущую ферменту дикого типа каталитическую активность и широкую, преимущественно гидрофобную специфичность. С целью выяснения факторов, влияющих на субстратную специфичность металлокарбоксипептидаз, и причин расхождения со сложившимися представлениями нами была определена структура комплекса мутанта карбоксипептидазы Т с заменами G215S, A251G, T257A, D260G и T262D с аналогом переходного состояния N-сульфамоил-L-фенилаланином с разрешением 1,35 Å и проведено ее сравнение со структурой аналогичного комплекса, образованного карбоксипептидазой В. Сравнительное исследование позволило выявить ранее недооцененную структурную детерминанту субстратной специфичности металлокарбоксипептидаз и показало, что при мутации пяти аминокислотных остатков (а.о.) в кармане первичной специфичности карбоксипептидазы Т удается добиться практически полного структурного соответствия аналогичному карману в карбоксипептидазе В, однако это не приводит к принципиальному изменению субстратной специфичности мутанта из-за различий в строении подвижной петли, расположенной у входа в активный центр карбоксипептидаз и влияющей на индуцируемую субстратом конформационную перестройку этого центра.
Текст статьи
Сноски
* Первоначально английский вариант рукописи опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow) http://protein.bio.msu.ru/biokhimiya, в рубрике «Papers in Press», BM18-165, 12.11.2018.
** Статья на английском языке опубликована в томе 83, вып. 12, 2018.
*** Адресат для корреспонденции.
Финансирование
Работа выполнена при поддержке РНФ (грант № 17-14-01256) в части выделения, очистки, поиска условий кристаллизации белка, решения, уточнения и анализа структур, Федеральной космической программы 2016–2025 (ОКР «МКС (Наука)») в части выращивания кристаллов в условиях невесомости, а также Министерства науки и высшего образования в рамках выполнения работ по Государственному заданию ФИНЦ «Кристаллография и фотоника» РАН в части получения рентгеноструктурных наборов.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Соблюдение этических норм
Настоящая работа не содержит описания каких-либо исследований с использованием людей и животных в качестве объектов.
Список литературы
1. Perez-Silva, J.G., Espanol, Y., Velasco, G., and Quesada, V. (2016) The degradome database: expanding roles of mammalian proteases in life and disease, Nucleic Acids Res., 44, D351–D355.
2. Turk, B., Turk, D., and Turk, V. (2012) Protease signalling: the cutting edge, EMBO J., 31, 1630–1643.
3. Turk, B. (2006) Targeting proteases: successes, failures and future prospects, Nat. Rev. Drug Discov., 5, 785–799.
4. Tanco, S., Tort, O., Demol, H., Aviles, F.X., Gevaert, K., Van Damme, P., and Lorenzo, J. (2015) C-terminomics screen for natural substrates of cytosolic carboxypeptidase 1 reveals processing of acidic protein C termini, Mol. Cell. Proteomics., 14, 177–190.
5. Sapio, M.R., and Fricker, L.D. (2014) Carboxypeptidases in disease: insights from peptidomic studies, Proteomics Clin. Appl., 8, 327–337.
6. Остерман, А.Л., Степанов, В.М., Руденская, Г.Н., Ходова, О.М., Цаплина, И.А. (1984) Карбоксипептидаза Т – внеклеточная карбоксипептидаза термоактиномицетов – отдаленный аналог животных карбоксипептидаз, Биохимия, 49, 292–301.
7. Teplyakov, A., Polyakov, K., Obmolova, G., Strokopytov, B., Kuranova, I., Osterman, A.L., Grishin, N., Smulevitch, S., Zagnitko, O., and Galperina, O. (1992) Crystal structure of carboxypeptidase T from Thermoactinomyces vulgaris, Eur. J. Biochem., 208, 281–288.
8. Schechter, I., and Berger, A. (1967) On the size of the active site in proteases. I. Papain, Biochem. Biophys. Res. Commun., 27, 157–162.
9. Auld, D.S., Galdes, A., Geoghegan, K.F., Holmquist, B., Martinelli, R., and Vallee, B.L. (1984) Cryospectrokinetic characterization of intermediates in biochemical reactions: carboxypeptidase A, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5041–5045.
10. Reeke, G.N., Hartsuck, J.A., Ludwig, M.L., Quiocho, F.A., Steitz, T.A., and Lipscomb, W.N. (1967) The structure of carboxypeptidase a, vi. Some results at 2.0-a resolution, and the complex with glycyl-tyrosine at 2.8-a resolution, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 58, 2220–2226.
11. Gardell, S.J., Craik, C.S., Clauser, E., Goldsmith, E. J., Stewart, C.B., Graf, M., and Rutter, W.J. (1988) A novel rat carboxypeptidase, CPA2: characterization, molecular cloning, and evolutionary implications on substrate specificity in the carboxypeptidase gene family, J. Biol. Chem., 263, 17828–17836.
12. Stepanov, V.M. (1995) Carboxypeptidase T, Methods Enzymol., 248, 675–683.
13. Osterman, A.L., Grishin, N.V., Smulevitch, S.V., Matz, M.V., Zagnitko, O.P., Revina, L.P., and Stepanov, V.M. (1992) Primary structure of carboxypeptidase T: delineation of functionally relevant features in Zn-carboxypeptidase family, J. Protein. Chem., 11, 561–570.
14. Reeck, G.R., Walsh, K.A., Hermodson, M.A., and Neurath, H. (1971) New forms of bovine carboxypeptidase B and their homologous relationships to carboxypeptidase A, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 68, 1226–1230.
15. Bunnage, M.E., Blagg, J., Steele, J., Owen, D.R., Allerton, C., McElroy, A.B., Miller, D., Ringer, T., Butcher, K., Beaumont, K., Evans, K., Gray, A.J., Holland, S.J., and Feeder, N., (2007) Discovery of potent & selective inhibitors of activated thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor for the treatment of thrombosis, J. Med. Chem., 50, 6095–6103.
16. Bown, D.P., and Gatehouse, J.A. (2004) Characterization of a digestive carboxypeptidase from the insect pest corn earworm (Helicoverpa armigera) with novel specificity towards C-terminal glutamate residues, Eur. J. Biochem., 271, 2000–2011.
17. Edge, M., Forder, C., Hennam, J., Lee, I., Tonge, D., Hardern, I., Fitton, J., Eckersley, K., East, S., Shufflebotham, A., Blakey, D., and Slater, A. (1998) Engineered human carboxypeptidase B enzymes that hydrolyse hippuryl-L-glutamic acid: reversed-polarity mutants, Protein Eng., 11, 1229–1234.
18. Grishin, A.M., Akparov V.Kh., and Chestukhina, G.G. (2008) Leu254 residue and calcium ions as new structural determinants of carboxypeptidase T substrate specificity, Biochemistry (Moscow), 73, 1140–1145.
19. Akparov, V.Kh., Grishin, A.M., Yusupova, M.P., Ivanova, N.M., and Chestukhina, G.G. (2007) Structural principles of the wide substrate specificity of Thermoactinomyces vulgaris carboxypeptidase T. reconstruction of the carboxypeptidase B primary specificity pocket, Biochemistry (Moscow), 72, 416–423.
20. Акпаров В.Х., Белянова Л.П., Баратова Л.А., Степанов В.М. (1979) Субтилизин 72 – сериновая протеаза из B. subtilis штамма 72 – фермент, близкий субтилизину Карлсберг, Биохимия, 44, 886–891.
21. Люблинская Л.А., Якушева Л.Д., Степанов В.М. (1977) Синтез пептидных субстратов субтилизина и их аналогов, Биоорганическая химия, 3, 273–279.
22. Cueni, L.B., Bazzone, T.J., Riordan, J.F., and Vallee, B.L. (1980) Affinity chromatographic sorting of carboxypeptidase A and its chemically modified derivatives, Anal. Biochem., 107, 341–349.
23. Novagen pET System Manual TB055 (1997) 7th Edn, Novagen Madison W.I.
24. Trachuk, L., Letarov, A., Kudelina, I.A., Yusupova, M.P., and Chestukhina, G.G. (2005) In vitro refolding of carboxypeptidase T precursor from Thermoactinomyces vulgaris obtained in Escherichia coli as cytoplasmic inclusion bodies, Protein. Expr. Purif., 40, 51–59.
25. Bradford, M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem., 72, 248–254.
26. Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 227, 680–685.
27. Cornish-Bowden, A. (2013) Fundamentals of enzyme kinetics, 4th Edn., Wiley-VCH, Weinheim.
28. Krissinel, E., and Henrick, K. (2007) Inference of macromolecular assemblies from crystalline state, J. Mol. Biol., 372, 774–797.
29. Takahashi, S., Tsurumura, T., Aritake, K., Furubayashi, N., Sato, M., Yamanaka, M., Hirota, E., Sano, S., Kobayashi, T., Tanaka, T., Inaka, K., Tanaka, H., and Urade, Y. (2010) High-quality crystals of human haematopoietic prostaglandin D synthase with novel inhibitors, Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun., 66, 846–850.
30. Куранова И.П., Смирнова Е.А., Абрамчик Ю.А., Чупова Л.А., Есипов Р.С., Акпаров В.Х., Тимофеев В.И., Ковальчук М.В. (2011) Выращивание кристаллов фосфопантетеин аденилилтрансферазы, карбоксипептидазы Т и тимидинфосфорилазы на международной космической станции методом встречной диффузии в капилляре, Кристаллография, 56, 944–951.
31. McCoy, A.J., Grosse-Kunstleve, R.W., Adams, P.D., Winn, M.D., Storoni, L.C., and Read, R.J. (2007) Phaser crystallographic software, J. Appl. Crystallogr., 40, 658–674.
32. Murshudov, G.N., Vagin, A.A., and Dodson, E.J. (1997) Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method, Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr., 53, 240–255.
33. Emsley, P., and Cowtan, K. (2004) Coot: model-building tools for molecular graphics, Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr., 60, 2126–2132.
34. Park, J.D., Kim, D.H., Kim, S.J., Woo, J.R., and Ryu, S.E. (2002) Sulfamide-based inhibitors for carboxypeptidase A. Novel type transition state analogue inhibitors for zinc proteases, J. Med. Chem., 45, 5295–5302.
35. Akparov, V.Kh., Sokolenko, N., Timofeev, V., and Kuranova, I. (2015) Structure of the complex of carboxypeptidase B and N-sulfamoyl-L–arginine, Acta. Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun., 71, 1335–1340.
36. Акпаров В.Х., Тимофеев В.И., Махсуди Н.Н., Куранова И.П. (2017) Пространственная структура свиной панкреатической карбоксипептидазы В с ацетат-ионом и двумя атомами цинка в активном центре, Кристаллография , 62, 224–228.
37. Akparov, V., Timofeev, V., Khaliullin, I., Svedas, V., and Kuranova, I. (2018) Structure of the carboxypeptidase B complex with N-sulfamoyl-L-phenylalanine – a transition state analog of non-specific substrate, J. Biomol. Struct. Dyn., 36, 956–965.
38. Akparov, V., Timofeev, V., Khaliullin, I., Svedas, V., Kuranova, I., and Rakitina, T. (2017) Crystal structures of carboxypeptidase T complexes with transition-state analogs, J. Biomol. Struct. Dyn., 1–9.
39. Aloy, P., Companys, V., Vendrell, J., Aviles, F.X., Fricker, L.D., Coll, M., and Gomis-Ruth, F.X. (2001) The crystal structure of the inhibitor-complexed carboxypeptidase D domain II and the modeling of regulatory carboxypeptidases, J. Biol. Chem., 276, 16177–16184.