БИОХИМИЯ, 2018, том 83, вып. 11, с. 1722–1735

УДК 57.087;577.152.321

Комплексный анализ углевод-активных ферментов мицелиального гриба Scytalidium candidum 3C*

© 2018 И.Ю. Павлов 1, Е.В. Энейская 1, К.С. Бобров 1, Д.Е. Полев 2, Д.Р. Иванен 1, А.Т. Копылов 3, С.Н. Нарыжный 1,3, А.А. Кульминская 1,4**

1 Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова НИЦ «Курчатовский институт», 188300 Гатчина, Ленинградская область, Россия; электронная почта: kulminskaya_aa@pnpi.nrcki.ru

2 Ресурсный центр «Центр Биобанк» Научного парка Санкт-Петербургского Государственного университета, 198504 Петергоф, Санкт-Петербург, Россия; электронная почта: brantoza@gmail.com

3 Институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАН, 119121 Москва, Россия; электронная почта: snaryzhny@mail.ru

4 Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого, кафедра «Медицинская физика», 194021 Санкт-Петербург, Россия; электронная почта: medphiz@gmail.com

Поступила в редакцию 15.12.2017
После доработки 05.07.2018

DOI: 10.1134/S0320972518110106

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: CAZy-мы, лигноцеллюлазы, гликозидгидролазы, пара/нитрофенил-β-S/D-гликобиозиды.

Аннотация

Полное ферментативное расщепление растительных полисахаридов является результатом совместного действия различных углевод-активных ферментов (CAZy-мов). В данной работе мы продемонстрировали потенциал мицелиального гриба Scytalidium candidum 3C в переработке растительной биомассы. В результате структурной аннотации улучшенной сборки генома S. candidum 3C и функциональной аннотации CAZy-мов были обнаружены предполагаемые последовательности генов, кодирующих такие белки. Установлено, что количество генов в геноме, кодирующих CAZy-мы, составляет 190, из них идентифицировано 104 гликозидгидролазы, 52 гликозилтрансферазы, 28 окислительных ферментов и 6 углеводэстераз. Также были идентифицированы 14 углевод-связывающих доменов (СBM). Проведен анализ гликозидгидролаз, секретируемых в процессе роста на трех средах, с использованием разнообразных субстратов. Масс-спектрометрический анализ культуральной жидкости гриба выявил наличие пептидов, идентичных 36 гликозидгидролазам, трем белкам без известной ферментативной функции, принадлежащим этой же группе семейств, и 11 окислительным ферментам. Установлен уровень активностей эндо-гемицеллюлаз с использованием специально синтезированных для этой цели субстратов, у которых гликозидная связь между моносахаридными остатками была заменена на тио-связь. В ходе анализа полученного профиля были выявлены, частично очищены и идентифицированы четыре β-ксиланазы из 10-го семейства и две β-глюканазы 7 и 55-го семейств гликозидгидролаз.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи:

captcha

Сноски

* Приложение к статье на английском языке опубликовано на сайте журнала «Biochemistry» (Moscow) и на сайте издательства Springer (link.springer.com), том 83, вып. 11, 2018.

** Адресат для корреспонденции.

Финансирование

Работа выполнена при поддержке РНФ (проект № 16-14-00109). Масс-спектрометрические работы выполнены на приборной базе ЦКП «Протеом человека» в ИБМХ им. В.Н. Ореховича (Москва), который поддерживается Министерством образования и науки РФ (соглашение 14.621.21.0017, уникальный идентификатор проекта RFMEFI62117X0017). Секвенирование и сборка генома и транскриптома были выполнены с использованием оборудования ресурсных центров «Развитие молекулярных и клеточных технологий» и «Центр Биобанк» Научного парка СПбГУ.

Благодарности

Авторы благодарны Елене Сергеевне Петренко за помощь в пробоподготовке для масс-спектрометрии и Александру Чеблокову за конструктивную дискуссию при интерпретации результатов биоинформатического анализа.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм

Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с использованием людей и животных в качестве объектов.

Список литературы

1. De Vries, R.P., and Visser, J. (2001) Aspergillus enzymes involved in degradation of plant cell wall polysaccharides, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 65, 497–522.

2. Henrissat, B., Callebaut, I., Fabrega, S., Lehn, P., Mornon, J.P., and Davies, G. (1995) Conserved catalytic machinery and the prediction of a common fold for several families of glycosyl hydrolases, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 7090–7094.

3. Lombard, V., Golaconda Ramulu, H., Drula, E., Coutinho, P.M., and Henrissat, B. (2014) The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013, Nucleic Acids Res., 42, D490–495.

4. Henrissat, B., and Bairoch, A. (1996) Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J., 316, 695–696.

5. Davies, G.J., and Sinnott, M.L. (2008) Sorting the diverse: the sequence-based classifications of carbohydrate-active enzymes, Biochem. J., 30, 26–32.

6. Gupta, V.K., Steindorff, A.S., de Paula, R.G., Silva-Rocha, R., Mach-Aigner, A.R., Mach, R.L., and Silva, R.N. (2016) The post-genomic era of Trichoderma reesei: what’s next? Trends Biotechnol., 34, 970–982.

7. Payne, C.M., Knott, B.C., Mayes, H.B., Hansson, H., Himmel, M.E., Sandgren, M., Stahlberg, J., and Beckham, G.T. (2015) Fungal cellulases, Chem. Rev., 115, 1308–1448.

8. Peterson, R., and Nevalainen, H. (2012) Trichoderma reesei RUT-C30 – thirty years of strain improvement, Microbiology, 158, 58–68.

9. Culleton, H., McKie, V., and de Vries, R.P. (2013) Physiological and molecular aspects of degradation of plant polysaccharides by fungi: what have we learned from Aspergillus? Biotechnol. J., 8, 884–894.

10. Родионова Н.А., Тиунова Н.А., Фениксова Р.В., Кудряшова Т.И., Мартинович Л.И. (1974) Целлюлолитические ферменты Geotrichum candidum, Докл. Академии наук СССР, 214, 1206–1209.

11. Тиунова Н.А., Родионова Н.А., Мартинович Л.И., Гоголев М.Н. (1980) Получение целлюлолитических ферментов из Geotrichum candidum, Прикл. биохим. и микробиол., 16, 185–190.

12. Родионова Н.А., Кобзева Н.Я., Загустина Н.А., Максимов В.И., Безбородов А.М. (1984) Целлюлолитические ферменты Geotrichum candidum, Микробиология, 53, 237–241.

13. Родионова Н.А., Мартинович Л.И., Куртева И., Акпаров В.Х., Безбородов А.М. (1989) Очистка и характеристика эндо-1,4-β-глюканазы I из Geotrichum candidum 3C, Прикл. биохим. и микробиол., 25, 172–177.

14. Васильева Н.В., Родионова Н.А., Мартинович Л.И., Тавобилов И.М., Безбородов А.М. (1989) Очистка эндо-1,4-β-глюканазы II, связывающейся с микрокристаллической целлюлозой, из препарата целлюлазы Geotrichum candidum 3C, Прикл. биохим. и микробиол., 25, 322–332.

15. Родионова Н.А., Мартинович Л.И., Русаков А.Е., Захаров В.И. (1989) Характеристика продуктов гидролиза аморфной целлюлозы и целлоолигосахаридов эндоглюканазой I из Geotrichim candidum 3C, Прикл. биохим. и микробиол., 25, 473–477.

16. Родионова Н.А., Дубовая Н.В., Энейская Е.В., Мартинович Л.И., Грашева И.М., Безбородов А.М. (2000) Очистка и характеристика эндо-1,4-β-ксиланазы из Geotrichum candidum 3C, Прикл. биохим. и микробиол., 36, 535–540.

17. Лапин В.В., Родионова Н.А., Загустина Н.А., Капанчан А.Т., Дубовая Н.В., Безбородов А.М. (2002) Применение ферментного препарата целлокандин из Geotrichum candidum 3С-106 для роспуска макулатуры и обезвоживания суспензии целлюлозы, Прикл. биохим. и микробиол., 38, 452–454.

18. Borisova, A.S., Eneyskaya, E.V., Bobrov, K.S., Jana, S., Logachev, A., Polev, D.E., Lapidus, A.L., Ibatullin, F.M., Saleem, U., Sandgren, M., Payne, C.M., Kulminskaya, A.A., and Stahlberg, J. (2015) Sequencing, biochemical characterization, crystal structure and molecular dynamics of cellobiohydrolase Cel7A from Geotrichum candidum 3C, FEBS J., 282, 4515–4537.

19. Polev, D.E., Bobrov, K.S., Eneyskaya, E.V., and Kulminskaya, A.A. (2014) Draft genome sequence of Geotrichum candidum strain 3C, Genome Announc., 2, e00956-14.

20. Morel, G., Sterck, L., Swennen, D., Marcet-Houben, M., Onesime, D., Levasseur, A., Jacques, N., Mallet, S., Couloux, A., Labadie, K., Amselem, J., Beckerich, J.-M., Henrissat, B., van de Peer, Y., Wincker, P., Souciet, J.-L., Gabaldon, T., Tinsley, C. R., and Casaregola, S. (2015) Differential gene retention as an evolutionary mechanism to generate biodiversity and adaptation in yeasts, Sci. Rep., 5, 11571.

21. Pavlov, I.Yu., Bobrov, K.S., Sumacheva, A.D., Masharsky, A.E., Polev, D.E., Zhurishkina, E.V., and Kulminskaya, A.A. (2018) Scytalidium candidum 3C is a new name for the Geotrichum candidum Link 3C strain, J. Basic Microbiol., https://doi.org/10.1002/jobm.201800066.

22. Giraldo, A., Sutton, D. A., Gene, J., Fothergill, A. W., Cano, J., and Guarro, J. (2013) Rare arthroconidial fungi in clinical samples: Scytalidium cuboideum and Arthropsis hispanica, Mycopathologia, 175, 115–121.

23. Kaur, A.P., Nocek, B.P., Xu, X., Lowden, M.J., Leyva, J.F., Stogios, P.J., Cui, H., Di Leo, R., Powlowski, J., Tsang, A., and Savchenko, A. (2015) Functional and structural diversity in GH62 α-L-arabinofuranosidases from the thermophilic fungus Scytalidium thermophilum, Microb. Biotechnol., 8, 419–433.

24. Basotra, N., Kaur, B., Di Falco, M., Tsang, A., and Chadha, B.S. (2016) Mycothermus thermophilus (Syn. Scytalidium thermophilum): Repertoire of a diverse array of eficient cellulases and hemicellulases in the secretome revelaed, Biores. Technol., 222, 413–421.

25. Boonlue, S., Aimi, T., and Morinaga, T. (2003) Molecular characterization of a xylanase-producing thermophilic fungus isolated from Japanese soil, Curr. Microbiol., 47, 119–124.

26. Klingstrom, A., and Beyer, L. (1965) Two new species of Scytalidium, with antagonistic properties to Fomes annosus, Svensk Botanisk Tidskrift, 59, 30–36.

27. Klingstrom, A.E., and Johansson, S.M. (1973) Antagonism of Scytalidium isolates against wood decay fungi, Phytopathology, 63, 473–479.

28. O’Connell, J., Schulz-Trieglaff, O., Carlson, E., Hims, M.M., Gormley, N.A., and Cox, A.J. (2015) NxTrim: optimized trimming of Illumina mate pair reads, Bioinformatics, 31, 2035–2037.

29. Chevreux, B., Wetter, T., and Suhai, S. (1999) Genome sequence assembly using trace signals and additional sequence information, Computer science and biology. Proceedings of the German conference on bioinformatics, 99, 45–56.

30. Cantarel, B.L., Korf, I., Robb, S.M. C., Parra, G., Ross, E., Moore, B., Holt, C., Sanchez Alvarado, A., and Yandell, M. (2008) MAKER: an easy-to-use annotation pipeline designed for emerging model organism genomes, Genome Res., 18, 188–196.

31. Korf, I. (2004) Gene finding in novel genomes, BMC bioinformatics, 5, 59.

32. Conesa, A., Gotz, S., Garcia-Gomez, J.M., Terol, J., Talon, M., and Robles, M. (2005) Blast2GO: a universal tool for annotation, visualization and analysis in functional genomics research, Bioinformatics, 21, 3674–3676.

33. Yin, Y., Mao, X., Yang, J., Chen, X., Mao, F., and Xu, Y. (2012) dbCAN: a web resource for automated carbohydrate-active enzyme annotation, Nucleic Acids Res., 40, W445–451.

34. Petersen, T.N., Brunak, S., von Heijne, G., and Nielsen, H. (2011) SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions, Nat. Meth., 8, 785–786.

35. Helferich, B., and Schmitz-Hillebrecht, E. (1933) Eine neue methode zur synthese von glykosiden der phenole, Berichte Deutschen Chemischen Gesellschaft, 66, 378–383.

36. Dess, D., Kleine, H.P., Weinberg, D.V., Kaufman, R.J., and Sidhu, R.S. (1981) Phase-transfer catalyzed synthesis of acetylated aryl β-D-glucopyranosides and aryl β-D-galactopyranosides, Synthesis, 883–885.

37. Ibatullin, F.M., Selivanov, S.I., and Shavva, A.G. (2001) A general procedure for conversion of S-glycosyl isothiourea derivatives into thioglycosides, thiooligosaccharides and glycosyl thioesters, Synthesis, 3, 0419–0422.

38. Ibatullin, F.M., Shabalin, K.A., Janis, J.V., and Selivanov, S.I. (2001) Stereoselective synthesis of thioxylooligosaccharides from S-glycosyl isothiourea precursors, Tetrahedr. Lett., 42, 4565–4567.

39. Muhlmann, M., Kunze, M., Ribeiro, J., Geinitz, B., Lehmann, C., Schwaneberg, U., Commandeur, U., and Buchs, J. (2017) Cellulolytic RoboLector – towards an automated high-throughput screening platform for recombinant cellulase expression, J. Biol. Eng., 11, 1.

40. Wisniewski, J.R., Zougman, A., Nagaraj, N., and Mann, M. (2009) Universal sample preparation method for proteome analysis, Nat. Meth., 6, 359–362.

41. Naryzhny, S.N., Maynskova, M.A., Zgoda, V.G., Ronzhina, N.L., Kleyst, O.A., Vakhrushev, I.V., and Archakov, A.I. (2016) Virtual-experimental 2DE approach in chromosome-centric human proteome project, J. Proteome Res., 15, 525–530.

42. Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., and Lipman, D.J. (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs, Nucleic Acids Res., 25, 3389–3402.

43. Golubev, A.M., Brandao Neto, J.R., Eneyskaya, E.V., Kulminskaya, A.A., Kerzhner, M.A., Neustroev, K.N., and Polikarpov, I. (2000) Purification, crystallization and preliminary X-ray study of β-xylosidase from Trichoderma reesei, Acta Crystallogr. D Biol. Cristallogr., 56, 1058–1060.

44. Shabalin, K.A., Kulminskaya, A.A., Savel’ev, A.N., Shishlyannikov, S.M., and Neustroev, K.N. (2002) Enzymatic properties of α-galactosidase from Trichoderma reesei in the hydrolysis of galactooligosaccharides, Enzyme Microb. Technol., 30, 231–239.

45. Harris, P.V., Welner, D., McFarland, K.C., Re, E., Navarro Poulsen, J.-C., Brown, K., Salbo, R., Ding, H., Vlasenko, E., Merino, S., Xu, F., Cherry, J., Larsen, S., and Lo Leggio, L. (2010) Stimulation of lignocellulosic biomass hydrolysis by proteins of glycoside hydrolase family 61: structure and function of a large, enigmatic family, Biochemistry, 49, 3305–3316.

46. Hartland, R.P., Fontaine, T., Debeaupuis, J.P., Simenel, C., Delepierre, M., and Latge, J.P. (1996) A novel β-(1,3)-glucanosyltransferase from the cell wall of Aspergillus fumigatus, J. Biol. Chem., 271, 26843–26849.

47. Liu, Q.P., Sulzenbacher, G., Yuan, H., Bennett, E.P., Pietz, G., Saunders, K.,Spence, J., Nudelman, E., Le- very, S.B., White, T., Neveu, J.M., Lane, W.S., Bourne, Y., Olsson, M.L., Henrissat, B., and Clausen, H. (2007) Bacterial glycosidases for the production of universal red blood cells, Nat. Biotechnol., 25, 454–464.

48. Garron, M.-L., and Cygler, M. (2014) Uronic polysaccharide degrading enzymes, Curr. Opin. Struct. Biol., 28, 87–95.

49. Kaoutari, A.E., Armougom, F.,Gordon, J.I., Raoult, D., and Henrissat, B. (2013) The abundance and variety of carbohydrate-active enzymes in the human gut microbiota, Nat. Rev. Microbiol., 11, 497–504.

50. Van Munster, J.M., Daly, P., Delmas, S., Pullan, S.T., Blythe, M.J., Malla, S., Kokolski, M., Noltorp, E.C.M., Wennberg, K., Fetherston, R., Beniston, R., Yu. X., Dupree, P., Archer, D.B. (2014) The role of carbon starvation in the induction of enzymes that degrade plant-derived carbohydrates in Aspergillus niger, Fungal Genet. Biol., 72, 34–47.

51. Kubicek, C.P. (2013) System biological approaches towards understanding cellulase production by Trichoderma reesei, J. Biotechnol., 163, 133–142.

52. Алимова Ф.К. (2006) Промышленное применение грибов рода Trichoderma, Монография, КГУ, Казань.

53. Tomaz, C.T., and Queiroz, J.A. (2004) Fractionation of Trichoderma reesei cellulases by hydrophobic interaction chromatography on phenyl-sepharose, Biotechnol. Lett., 26, 223–227.

54. Battaglia E., Benoit I., van den Brink, J., Wiebenga, A., Coutinho, P.M., Henrissat, B., and de Vries, R.P. (2011) Carbohydrate-active enzymes from the zygomycete fungus Rhizopus oryzae: a highly specialized approach to carbohydrate degradation depicted at genome level, BMC Genomics, 12, 38–50.