Влияние добавленной дисульфидной связи на структуру и активность пептидного фрагмента эндостатина

1 Department of Biology, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran

2 Department of Biology, Faculty of Sciences, University of Guilan, Rasht, Iran; E-mail: sariri@guilan.ac.ir

3 Department of Biochemistry, Faculty of Biological Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran; E-mail: saman_h@modares.ac.ir

Поступила в редакцию 21.11.2017
После доработки 21.06.2018

DOI: 10.1134/S032097251811009X

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: пептидные фрагменты эндостатина, структура пептидов, ангиогенез, опухолевый рост, сигнальные пути, ассоциированные с ангиогенезом.

Аннотация

Было проведено сравнение структуры и функции содержащего 27 аминокислотных остатков N-концевого фрагмента эндостатина человека (ES-Zn) и мутантного пептида (ES-SSZn), полученного в результате добавления к N-концевому участку ES-Zn трипептида Cys-Pro-Ala и замены аминокислотного остатка Asn16 на остаток Cys с образованием дисульфидной связи. Сравнение структуры пептидов проводили с помощью метода кругового дихроизма в дальнем ультрафиолете, регистрации собственной (внутренней) флуоресценции и метода молекулярной динамики. Было показано, что в пептиде ES-SSZn по сравнению с ES-Zn наблюдаются значительные структурные изменения. Так, исчезает конформер β-складчатой структуры, изменяется структура N-концевой петли, а также динамические свойства остова всего пептида. По сравнению с ES-Zn и полноразмерным эндостатином человека ES-SSZn в условиях in vitro демонстрировал в ~2 и 3 раза меньший потенциал в индукции каспаза-3-зависимого апоптоза эндотелиальных клеток пупочной вены человека (Human umbilical vein endothelial cells, HUVECs) (p < 0,05). В то же время обработка клеток 4T1 метастазирующих опухолей молочной железы у мышей пептидами ES-Zn и ES-SSZn в течение 14 дней в количестве 5 мг/кг/день приводило к сходному уменьшению размера опухоли и сравнимому снижению уровня ангиогенеза (CD31 и CD34) и пролиферации клеток (Ki67), и, следовательно, к сходной индукции апоптоза (TUNEL, p53 и Bcl-2) в сравнении с необработанными контрольными клетками. Анализ лизатов клеток HUVEC и опухолевых клеток 4T1 с помощью вестерн-блоттинга также выявил сходную экспрессию пептидами ES-Zn и ES-SSZn ключевых медиаторов передачи сигнала, Akt и ERK1/2. В отличие от ранее полученных результатов, в настоящей работе показано, что активность исследованного фрагмента эндостатина не зависит от его строения, и укрепление структуры N-концевой петли путем введения дисульфидной связи приводило к снижению уровня структурных изменений.

Текст статьи

Сноски

* Адресат для корреспонденции.

Финансирование

Работа выполнена при финансовой поддержке научного совета Science and Research Branch of Islamic Azad University и University of Guilan.

Благодарности

Авторы выражают благодарность научным советам Islamic Azad University, University of Guilan и Tarbiat Modares University за оказанную ими поддержку при выполнении данного проекта.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм

В настоящей работе все эксперименты с лабораторными животными проводились в соответствии с национальными и международными требованиями документа «Weather all reports» и IACUC (Institutional Animal Care и Use Committee) Тегеранского медицинского университета. В каждом случае авторы получали одобрение на проведение работ от IACUC Тегеранского медицинского университета.

Список литературы

1. O’Reilly, M.S., Boehm, T., Shing, Y., Fukai, N., Vasios, G., Lane, W.S., Flynn, E., Birkhead, J.R., Olsen, B.R., and Folkman, J. (1997) Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth, Cell, 88, 277–285.

2. Folkman, J. (2006) Antiangiogenesis in cancer therapy – endostati and its mechanisms of action, Exp. Cell. Res., 312, 594–607.

3. Ding, Y.H., Javaherian, K., Lo K.M., Chopra, R., Boehm, T., Lanciotti, J., Harris, B.A., Li, Y., Shapiro, R., Hohenester, E., Timpl, R., Folkman, J., and Wiley, D.C. (1998) Zinc dependent dimers observed in crystals of human endostatin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 10443–10448.

4. Hohenester, E., Sasaki, T., Olsen, B.R., and Timpl, R. (1998) Crystal structure of the angiogenesis inhibitor endostatin at 1.5 Å resolution, EMBO J., 17, 1656–1664.

5. Fu, Y., and Luo, Y. (2010) The N-terminal integrity is critical for the stability and biological functions of endostatin, Biochemistry, 49, 6420–6429.

6. Boehm, T., O’Reilly, M.S., Keough, K., Shiloach, J., Shapiro, R., and Folkman, J. (1998) Zinc-binding of endostatin is essential for its anti-angiogenic activity, Biochem. Biophys. Res. Commun., 252, 190–194.

7. Hohenester, E., Sasaki, T., Mann, K., and Timpl, R. (2000) Variable zinc coordination in endostatin, J. Mol. Biol., 297, 1–6.

8. Fu, Y., and Luo, Y. (2010) The N-terminal integrity is critical for the stability and biological functions of endostatin, Biochemistry, 49, 6420–6429.

9. Tjin Tham Sjin, R.M., Satchi-Fainaro, R., Birsner, A.E., Ramanujam, V.M., Folkman, J., and Javaherian, K. (2005) A 27-amino-acid synthetic peptide corresponding to the NH2-terminal zinc-binding domain of endostatin is responsible for its anti-tumor activity, Cancer Res., 65, 3656–3663.

10. Chamani, R., Asghari, S.M., Alizadeh, A.M., Eskandari, S., Mansouri, K., Khodarahmi, R., Taghdir, M., Heidari, Z., Gorji, A., Aliakbar, A., Ranjbar, B., and Khajeh, K. (2015) Engineering of a disulfide loop instead of a Zn binding loop restores the anti-proliferative, anti-angiogenic and antitumor activities of the N-terminal fragment of endostatin: Mechanistic and therapeutic insights, Vascular Pharmacol., 72, 73–82.

11. Mostafaie, A., Bidmeshkipour, A., Shirvani, Z., Mansouri, K., and Chalabi, M. (2008) A proper new collagenase for isolation of cells from different tissue, Appl. Biochem. Biotechnol., 144, 123–131.

12. Chamani, R., Asghari, S.M., Alizadeh, A.M., Mansouri, K., Doroudi, T., Kolivand, P.H., Ghafouri, H., Ehtesham, S., Rabouti, H., and Mehrnejad, F. (2016) The antiangiogenic and antitumor activities of the N-terminal fragment of endostatin augmented by Ile/Arg substitution: The overall structure implicated the biological activity, Biochim. Biophys. Acta, 1864, 1765–1774.

13. Khori, V., Amani Shalamzari, S., Isanejad, A., Alizadeh, A.M., Alizadeh, S., Khodayari, S., Khodayari, H., Shahbazi, S., Zahedi, A., Sohanaki, H., Khaniki, M., Mahdian, R., Saffari, M., and Fayad, R. (2015) Effects of exercise training together with tamoxifen in reducing mammary tumor burden in mice: possible underlying pathway of miR-21, Eur. J. Pharmacol., 765, 179–187.

14. Lanari, C., Luthy, I., Lamb, C.A., Fabris, V., Pagano, E., Helguero, L.A., Sanjuan, N., Merani, S., and Molinolo, A.A. (2001) Five novel hormone-responsive cell lines derived from murine mammary ductal carcinomas: in vivo and in vitro effects of estrogens and progestins, Cancer Res., 61, 293–302.

15. Mohsenikia, M., Alizadeh, A.M., Khodayari, S., Khodayari, H., Kouhpayeh, S.A., Karimi, A., Zamani, M., Azizian, S., and Mohagheghi, M.A. (2013) The protective and therapeutic effects of alphasolanine on mice breast cancer, Eur. J. Pharmacol., 718, 1–9.

16. Weidner, N., Semple, J.P., Welch, W.R., and Folkman, J. (1991) Tumor angiogenesis and metastasis correlation in invasive breast carcinoma, N. Engl. J. Med., 324,1–8.

17. Hammond, J.B., and Kruger, N.J. (1988) The Bradford method for protein quantitation, Methods Mol. Biol., 3, 25–32.

18. Comeau, S.R., Gatchell, D.W., Vajda, S., and Camacho, C.J. (2004) ClusPro: a fully automated algorithm for protein–protein docking, Nucleic Acids Res., 32, 96–99.

19. Comeau, S.R., Gatchell, D.W., Vajda, S., and Camacho, C.J. (2004) ClusPro: an automated docking and discrimination method for the prediction of protein complexes, Bioinformatics, 20, 45–50.

20. Sali, A., and Blundell, T.L. (1993) Comparative protein modelling by satisfaction of spatial restraints, J. Mol. Biol., 234, 779–815.

21. Van Der Spoel D., Lindahl, E., Hess, B., Groenhof, G., Mark, A.E., and Berendsen, H.J. (2005) GROMACS: fast, flexible, and free, J. Comput. Chem., 26, 1701–1718.

22. Hess, B., Kutzner, C., van der Spoel, D., and Lindahl, E. (2008) GROMACS 4: algorithms for highly efficient, load-balanced, and scalable molecular simulation, J. Chem. Theory. Comput., 4, 435–447.

23. Kabsch, W., and Sander, C. (1983) Dictionary of protein secondary structure: pattern recognition of hydrogen-bonded and geometrical features, Biopolymers, 22, 2577–2637.

24. Kang, H.Y., Shim, D., Kang, S.S., Chang, S.I., Kim, H.Y. (2006) Protein kinase B inhibits endostatin-induced apoptosis in HUVECs, J. Biochem. Mol. Biol., 39, 97–104.

25. Yuan, S., Fu, Y., Wang, X., Shi, H., Huang, Y., Song, X., Li, L., Song, N., and Luo, Y. (2008) Voltagede-pendent anion channel 1 is involved in endostatin-induced endothelial cell apoptosis, FASEB J., 22, 2809–2820.

26. Folkman, J. (2003) Angiogenesis and apoptosis, Semin. Cancer Biol., 13, 159–167.

27. Miyashita, T., and Reed, J.C. (1995) Tumor suppressor p53 is a direct transcriptional activator of the human bax gene, Cell, 80, 293–299.

28. Haldar, S., Negrini, M., Monne, M., Sabbioni, S., and Croce, C.M. (1994) Down-regulation of bcl-2 by p53 in breast cancer cells, Cancer Res., 54, 2095–2097.

29. Simons, M., Emma Gordon, E., Welsh, L.C. (2016) Mechanisms and regulation of endothelial VEGF receptor signaling, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 17, 611–625.

30. Hong, C.C., Peterson, Q.P., Hong, J.Y., and Peterson, R.T. (2006) Artery/vein specification is governed by opposing phosphatidylinositol-3 kinase and MAP kinase/ERK1/2 signaling, Curr. Biol., 16, 1366–1372.

31. Murakami, M. (2011) FGF-dependent regulation of VEGF receptor 2 expression in mice, J. Clin. Invest., 121, 2668–2678.

32. Shiojima, I., and Walsh, K. (2002) Role of Akt signaling in vascular homeostasis and angiogenesis, Circ. Res., 90, 1243–1250.

33. Olsson, A.K., Dimberg, A., Kreuger, J., and Welsh, L.C. (2016) VEGF receptor signalling – in control of vascular function, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 7, 359–371.

34. Krock, B.L., Skuli, N., and Simon, M.C. (2011) Hypoxia-induced angiogenesis: good and evil, Genes Cancer, 2, 1117–1133.

35. Hsu, M.J., Wu, C.Y., Chiang, H.H., Lai, Y.L., and Hung, S.L. (2010) PI3K/Akt signaling mediated apoptosis blockage and viral gene expression in oral epithelial cells during herpes simplex virus infection, J. Virus Res., 153, 36–43.

36. Zheng, J.H., Viacava, F.A., Kriwacki, R.W., and Moldoveanu, T. (2016) Discoveries and controversies in BCL-2 protein-mediated apoptosis, FEBS J., 283, 2690–2700.