БИОХИМИЯ, 2018, том 83, вып. 10, с. 1504–1522
УДК 577.112
Синтез в Escherichia coli и характеристика рекомбинантного эритропоэтина человека с дополнительным гепарин-связывающим доменом*,**
1 Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, 123098 Москва, Россия; электронная почта: alexander.v.gromov@gmail.com, akaryagina@gmail.com
2 Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии, 127550 Москва, Россия
3 НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Россия
4 Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра «Курчатовский институт», 117545 Москва, Россия
5 Институт геохимии и аналитической химии им. В.И. Вернадского РАН, 119991 Москва, Россия
6 «Московский технологический университет», Институт тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова, 119571 Москва, Россия
7 Научный центр психического здоровья, 115522 Москва, Россия
Поступила в редакцию 18.05.2018
DOI: 10.1134/S0320972518100068
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: эритропоэтин, Escherichia coli, гепарин-связывающий домен.
Аннотация
Синтезом в клетках Escherichia coli получен рекомбинантный эритропоэтин человека (EPO), несущий на N-конце дополнительный гепарин-связывающий белковый домен (HBD) из костного морфогенетического белка BMP-2. Разработана схема выделения, очистки и рефолдинга, позволяющая получить высокоочищенный белок HBD-EPO со структурой, близкой к нативной, содержащей, как показано с помощью MALDI-TOF-масс-спектрометрического анализа, две дисульфидные связи. Белок обладает биологической активностью in vitro в пролиферативном тесте на линии клеток эритролейкемии человека TF-1, активностью in vivo в тесте по возрастанию количества ретикулоцитов в крови после подкожного инъекционного введения и проявляет местную ангиогенную активность при подкожной имплантации диска из деминерализованного костного матрикса (ДКМ) с иммобилизированным на нем HBD-EPO. Разработан количественный сэндвич-ИФА тест, основанный на использовании кроличьей поликлональной сыворотки и коммерческих моноклональных антител к эритропоэтину, позволяющий определять концентрацию белка HBD-EPO в растворе. Исследование фармакокинетики полученного эритропоэтина показало, что препарат сходен по характеристикам с другими эритропоэтинами, синтезированными в клетках бактерий. HBD-EPO обратимо связывается в физиологических условиях с деминерализованным костным матриксом (ДКМ), часто используемым в качестве остеопластического материала для лечения патологий костной ткани. Данные по связыванию HBD-EPO с ДКМ и проявляемому при его введении в организм местному ангиогенному эффекту позволяют надеяться на успех при использовании HBD-EPO, иммобилизированного на ДКМ, в экспериментах по регенерации костной ткани.
Текст статьи
Сноски
* Первоначально английский вариант рукописи опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow) http://protein.bio.msu.ru/biokhimiya, в рубрике «Papers in Press», BM 18-141, 13.08.2018.
** Приложение к статье на английском языке опубликовано на сайте журнала «Biochemistry» (Moscow) и на сайте издательства Springer (link.springer.com), том 83, вып. 10, 2018.
*** Адресаты для корреспонденции.
Вклад авторов
А.С. Карягина, А.В. Громов и В.Г. Лунин составили план исследований и руководили работой; Т.М. Грунина, З.М. Галушкина и Д.А. Третяк, И.С. Бокша занимались наработкой и очисткой белков; М.С. Попонова и А.В. Демиденко получали антитела и проводили иммунологическое тестирование; П.А. Орлова и В.Н. Манских осуществляли гистологические исследования; Н.В. Струкова и М.С. Манухина проводили работу с лабораторными животными; К.Е. Никитин получал ДКМ; А.М. Лящук клонировал гены; С.А. Черепушкин тестировал активность белковых препаратов in vitro; Н.Б. Поляков, А.И. Соловьев и В.Г. Жуховицкий проводили масс-спектрометрический анализ. А.С. Карягина написала текст данного сообщения.
Финансирование
Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ (грант № 16-15-00133).
Благодарности
Авторы выражают благодарность Грумову Д.А. и Переборовой А.А. за помощь в проведении масс-спектрометрического анализа и плодотворное обсуждение полученных результатов, Лавровой Н.А. за проведение иммуноблоттинга, Соболевой Л.А. за выращивание биомассы для выделения белка.
Конфликт интересов
У авторов нет конфликта интересов ни в финансовой, ни в какой-либо иной сфере.
Соблюдение этических норм
Все процедуры, выполненные в исследованиях с участием животных, соответствовали этическим стандартам, утвержденным «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» в НИЦ ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России, где проводились исследования, положениями Директивы 2010/63/EU и Приложению А к Европейской Конвенции ETS № 123.
Список литературы
1. Krantz, S.B. (1991) Erythropoietin, Blood, 77, 419–434.
2. Shiozawa, Y., Jung, Y., Ziegler, A.M., Pedersen, E.A., Wang, J., Wang, Z., Song, J., Wang, J., Lee, C.H., Sud, S., Pienta, K.J., Krebsbach, P.H., and Taichman, R.S. (2010) Erythropoietin couples hematopoiesis with bone formation, PLoS One, 5, e10853.
3. Wu, C., Giaccia, A.J., and Rankin, E.B. (2014) Osteo-blasts: a novel source of erythropoietin, Curr. Osteoporos. Rep., 4, 428–432.
4. Li, C., Shi, C., Kim, J., Chen, Y., Ni, S., Jiang, L., Zheng, C., Li, D., Hou, J., Taichman, R.S., and Sun, H. (2015) Erythropoietin promotes bone formation through EphrinB2/EphB4 signaling, J. Dent. Res., 94, 455–463.
5. Holstein, J.H., Menger, M.D., Scheuer, C., Meier, C., Culemann, U., Wirbel, R.J., Garcia, P., and Pohlemann, T. (2007) Erythropoietin (EPO): EPO-receptor signaling improves early endochondral ossification and mechanical strength in fracture healing, Life Sci., 80, 893–900.
6. Holstein, J.H., Orth, M., Scheuer, C., Tami, A., Becker, S.C., Garcia, P., Histing, T., Morsdorf, P., Klein, M., Pohlemann, T., and Menger, M.D. (2011) Erythropoietin stimu- lates bone formation, cell proliferation, and angiogenesis in a femoral segmental defect model in mice, Bone, 49, 1037–1045.
7. Garcia, P., Speidel, V., Scheuer, C., Laschke, M.W., Holstein, J.H., Histing, T., Pohlemann, T., and Menger, M.D. (2011) Low dose erythropoietin stimulates bone healing in mice, J. Orthop. Res., 29, 165–172.
8. Rolfing, J.H.D., Bendtsen, M., Jensen, J., Stiehler, M., Foldager, C.B., Hellfritzsch, M.B., and Bunger, C. (2012) Erythropoietin augments bone formation in a rabbit posterolateral spinal fusion model, J. Orthop. Res., 30, 1083–1088.
9. Sun, H., Jung, Y., Shiozawa, Y., Taichman, R.S., and Krebsbach, P.H. (2012) Erythropoietin modulates the structure of bone morphogenetic protein 2-engineered cranial bone, Tissue Eng. Part A, 18, 2095–20105.
10. Rolfing, J.H., Jensen, J., Jensen, J.N., Greve, A.S., Lysdahl, H., Chen, M., Rejnmark, L., and Bunger, C. (2014) A single topical dose of erythropoietin applied on a collagen carrier enhances calvarial bone healing in pigs, Acta Orthop., 85, 201–209.
11. Patel, J.J., Modes, J.E., Flanagan, C.L., Krebsbach, P.H., Edwards, S.P., and Hollister, S.J. (2015) Dual delivery of EPO and BMP2 from a novel modular poly-ε-caprolactone construct to increase the bone formation in prefabricated bone flaps, Tissue Eng. Part C Methods, 21, 889–897.
12. Omlor, G.W., Kleinschmidt, K., Gantz, S., Speicher, A., Guehring, T., and Richter, W. (2016) Increased bone formation in a rabbit long-bone defect model after single local and single systemic application of erythropoietin, Acta Orthop., 87, 425–431.
13. Синюхин В.Н., Стецюк Е.А., Ловчинский Е.В. (1994) Фармакокинетика рекомбинантного человеческого эритропоэтина, Терапев. архив, 66, 60–62.
14. Egrie, J.C., Strickland, T.W., Lane, J., Aoki, K., Cohen, A.M., Smalling, R., Trail, G., Lin, F.K., Browne, J.K., and Hines, D.K. (1986) Characterization and biological effects of recombinant human erythropoietin, Immunobiology, 172, 213–224.
15. Egrie, J.C., Dwyer, E., Browne, J.K., Hitz, A., and Lykos, M.A. (2003) Darbepoetin alfa has a longer circulating half-life and greater in vivo potency than recombinant human erythropoietin, Exp. Hematol., 31, 290–299.
16. Wang, Y.J., Liu, Y.D., Chen, J., Hao, S.J., Hu, T., Ma, G.H., and Su, Z.G. (2010) Efficient preparation and PEGylation of recombinant human non-glycosylated erythropoietin expressed as inclusion body in E. coli, Int. J. Pharm., 386, 156–164.
17. Jeong, T.H., Son, Y.J., Ryu, H.B., Koo, B.K., Jeong, S.M., Hoang, P., Do, B.H., Song, J.A., Chong, S.H., Robinson, R.C., and Choe, H. (2014) Soluble expression and partial purification of recombinant human erythropoietin from E. coli, Protein Expr. Purif., 95, 211–218.
18. Boissel, J.P., Lee, W.R., Presnell, S.R., Cohen, F.E., and Bunn, H.F. (1993) Erythropoietin structure-function relationships. Mutant proteins that test a model of tertiary structure, J. Biol. Chem., 268, 15983–15993.
19. Narhi, L.O., Arakawa, T., Aoki, K., Wen, J., Elliott, S., Boone, T., and Cheetham, J. (2001) Asn to Lys mutations at three sites which are N-glycosylated in the mammalian protein decrease the aggregation of Escherichia coli-derived erythropoietin, Protein Eng., 14, 135–140.
20. Grunina, T.M., Demidenko, A.V., Lyaschuk, A.M., Poponova, M.S., Galushkina, Z.M., Soboleva, L.A., Cherepushkin, S.A., Polyakov, N.B., Grumov, D.A., Solovyev, A.I., Zhukhovitsky, V.G., Boksha, I.S., Subbotina, M.E., Gromov, A.V., Lunin, V.G., and Karyagina, A.S. (2017) Recombinant human erythropoietin with additional processable protein domains: purification of protein synthesized in Escherichia coli heterologous expression system, Biochemistry (Moscow), 82, 1285–1294.
21. Karyagina, A.S., Boksha, I.S., Grunina, T.M., Demidenko, A.V., Poponova, M.S., Sergienko, O.V., Lyaschuk, A.M., Galushkina, Z.M., Soboleva, L.A., Osidak, E.O., Semikhin, A.S., Gromov, A.V., and Lunin, V.G. (2016) Optimization of rhBMP-2 active-form production in a heterologous expression system using microbiological and molecular genetic approaches, Mol. Genet. Microbiol. Virol., 31, 208–213.
22. Bartov, M.S., Gromov, A.V., Poponova, M.S., Savina, D.M., Nikitin, K.E., Grunina, T.M., Manskikh, V.N., Gra, O.A., Lunin, V.G., Karyagina, A.S., and Gintsburg, A.L. (2016) Modern approaches to research of new osteogenic biomaterials on the model of regeneration of cranial critical-sized defects in rats, Bull. Exp. Biol. Med., 162, 273–276.
23. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J.V., and Mann, M. (2006) In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes, Nat. Protoc., 1, 2856–2860.
24. Sharapova, N.E., Kotnova, A.P., Galushkina, Z.M., Lavrova, N.V., Poletaeva, N.N., Tukhvatulin, A.E., Semikhin, A.S., Gromov, A.V., Soboleva, L.A., Ershova, A.S., Zaitsev, V.V., Sergeenko, O.V., Lunin, V.G., and Karyagina, A.S. (2010) Production of the recombinant human bone morphogenetic protein-2 in Escherichia coli and testing of its biological activity in vitro and in vivo, Mol. Biol. (Mosk.), 44, 923–930.
25. Karyagina, A.S., Boksha, I.S., Grunina, T.M., Demidenko, A.V., Poponova, M.S., Sergienko, O.V., Lyashchuk, A.M., Galushkina, Z.M., Soboleva, L.A., Osidak, E.O., Bartov, M.S., Gromov, A.V., and Lunin, V.G. (2017) Two variants of recombinant human bone morphogenetic protein 2 (rhBMP-2) with additional protein domains: synthesis in an Escherichia coli heterologous expression system, Biochemistry (Moscow), 82, 613–624.
26. Ramos, A.S., Schmidt, C.A., Andrade, S.S., Fronza, M., Rafferty, B., and Dalmora, S.L. (2003) Biological evaluation of recombinant human erythropoietin in pharmaceutical products, Braz. J. Med. Biol. Res., 36, 1561–1569.
27. Громов А.В., Никитин К.Е., Карпова Т.А., Зайцев В.В., Сидорова Е.И., Андреева Е.В., Бартов М.С., Мишина Д.М., Субботина М.Е., Шевлягина Н.В., Сергиенков М.А., Соболева Л.А., Котнова А.П., Шарапова Н.Е., Семихин А.С., Диденко Л.В., Карягина А.С., Лунин В.Г. (2012) Разработка методики получения остеопластического материала на основе деминерализованного костного матрикса с максимальным содержанием нативных факторов роста костной ткани, Биотехнология, 5, 66–75.
28. Osidak, E.O., Osidak, M.S., Sivogrivov, D.E., Portnaya, T.S., Grunina, T.M., Galushkina, Z.M., Lunin, V.G., Karyagina, A.S., and Domogatskii, S.P. (2014) Kinetics of BMP-2 release from collagen carrier: evaluation by enzyme immunoassay in the presence of plasma proteins, Bull. Exp. Biol. Med., 158, 104–108.
29. Heidenhain, M. (1905) Zeitschrift fur wissenschaftliche Mikroskopie und fur mikroskopische Technik, S. Hirzel-Leipzig, 22, 339.
30. Xing, G., Zhang, J., Chen, Y., and Zhao, Y. (2008) Identification of four novel types of in vitro protein modifications, J. Proteome Res., 7, 4603–4608.
31. Бирюкова Л.С., Ушакова А.И., Камшилова Н.И., Осе И.В., Акимов А.В., Скобелева Т.Ф., Бадмаев А.Л. (2011) Оценка безопасности и лечебной эффективности нового отечественного средства, стимулирующего эритропоэз (эпоэтин β), у больных, находящихся на программном гемодиализе, Нефрология и диализ, 13, 128–132.
32. Ruppert R., Hoffmann E., and Sebald, W. (1996) Human bone morphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site, which modifies its biological activity, Eur. J. Biochem., 237, 295–302.
33. Vo, T.N., Kasper, F.K., and Mikos, A.G. (2012) Strategies for controlled delivery of growth factors and cells for bone regeneration, Adv. Drug Deliv. Rev., 64, 1292–1309.
34. Zwingenberger, S., Langanke, R., Vater, C., Lee, G., Niederlohmann, E., Sensenschmidt, M., Jacobi, A., Bernhardt, R., Muders, M., Rammelt, S., Knaack, S., Gelinsky, M., Gunther, K.P., Goodman, S.B., and Stiehler, M. (2016) The effect of SDF-1α on low dose BMP-2 mediated bone regeneration by release from heparinized mineralized collagen type I matrix scaffolds in a murine critical size bone defect model, J. Biomed Mater. Res. A, 104, 2126–2134.
35. Ribatti, D., Presta, M., Vacca, A., Ria, R., Giuliani, R., Dell’Era, P., Nico, B., Roncali, L., and Dammacco, F. (1999) Human erythropoietin induces a pro-angiogenic phenotype in cultured endothelial cells and stimulates neovascularization in vivo, Blood, 93, 2627–2636.
36. Kimakova, P., Solar, P., Solarova, Z., Komel, R., and Debeljak, N. (2017) Erythropoietin and its angiogenic activity, Int. J. Mol. Sci., 18, E1519.
37. Гайфуллин Н.М., Карягина А.С., Громов А.В., Терпиловский А.А., Маланин Д.А., Демещенко М.В. и Новочадов В.В. (2016) Морфологические особенности остеоинтеграции при использовании титановых имплантатов с биоактивным покрытием и рекомбинантного костного морфогенетического белка rhBMP-2, Морфология, 149, 77–84.
38. Андреев А.Ю., Захаров В.Д., Зайратьянц О.В., Борзенок С.А., Хубецова М.Х., Осидак Е.О., Крашенинников С.В., Карягина А.С., Домогатский С.П. (2016) Перспективы использования фактора роста костной ткани в составе коллагенового носителя в целях укрепления роговицы (экспериментальное исследование), Современные технологии в офтальмологии, 4, 11–16.
39. Захаров В.Д., Андреев А.Ю., Зайратьянц О.В., Осидак Е.О., Борзенок С.А., Крашенинников С.В., Карягина А.С., Домогатский С.П. (2016) Морфологические изменения роговицы кроликов под влиянием фактора роста костной и хрящевой ткани rhBMP-2 в составе интракорнеального коллагенового имплантата, Клиническая и Экспериментальная морфология, 4, 36–42.
40. Захаров В.Д., Зайратьянц О.В., Андреев А.Ю., Осидак Е.О., Борзенок С.А., Крашенинников С.В., Карягина А.С., Домогатский С.П. (2016) Влияние фактора роста rhBMP-2 в составе коллагенового носителя на морфологические и биомеханические характеристики роговицы, Офтальмохирургия, 4, 20–28.
41. Bartov, M.S., Gromov, A.V., Manskih, V.N., Makarova, E.B., Rubshtein, A.P., Poponova, M.S., Savina, D.M., Savin, K.S., Nikitin, K.E., Grunina, T.M., Boksha, I.S., Orlova, P.A., Krivozubov, M.S., Subbotina, M.E., Lunin, V.G., Karyagina, A.S., and Gintsburg, A.L. (2017) Recombinant human Bone Morphogenetic Protein-2 (rhBMP-2) with additional protein domain synthesized in E. coli: in vivo osteoinduc tivity in experimental models on small and large laboratory animals, Bull. Exp. Biol. Med., 164, 148–151.
42. Chen, X., Zaro, J.L., and Shen, W.C. (2013) Fusion protein linkers: property, design and functionality, Adv. Drug Deliv. Rev., 65, 1357–1369.