Глутатионилирование α-субъединицы Na,K-АТPазы меняет конформацию фермента и его чувствительность к трипсинолизу^*,**

Аннотация

Ранее мы установили, что Na,K-АТРаза выделяется из солевых желез утки в частично глутатионилированном состоянии (до 13 из 23 цистеиновых остатков каталитической α-субъединицы фермента содержат связанный глутатион). Для установления влияния глутатионилирования на конформацию фермента, был проведен анализ трипсинолиза α-субъединицы для ряда конформаций Na,K-АТРазы, глутатионилированной в различной степени. Обработка Na,K-АТPазы трипсином в конформации Е1 приводит к появлению фрагмента с молекулярной массой (MM) ~80 кДа, а далее к образованию фрагментов с MM 40, 35,5 и 23 кДа (продукты «вторичного» и «третичного» протеолиза). Трипсинолиз Na,K-АТРазы в конформации E2 проходит аналогичным образом: появляются фрагменты с MM 40, 35,5 и 23 кДа. Деглутатионилирование существенно увеличивает скорость трипсинолиза как для E1, так и для E2 конформации. В E2 конформации характер протеолиза α-субъединицы Na,K-ATPазы, дополнительно глутатионилированной путем предварительной обработки окисленным глутатионом, сходен с таковым для частично деглутатионилированного препарата. В конформации E1 характер протеолиза дополнительно глутатионилированной α-субъединицы сходен с таковым для нативного препарата. В присутствии уабаина (конформация E2-уабаин) трипсинолиз α-субъединицы происходит быстрее, чем в присутствии ионов Na⁺ и K⁺. Дополнительное увеличение уровня глутатионилирования приводит к увеличению содержания более высокомолекулярных фрагментов по сравнению с нативным и деглутатионилированным препаратами. Полученные результаты были подтверждены методом молекулярного моделирования: было выявлено, что в конформации Е2Р-уабаин трипсину суммарно доступно больше участков протеолиза, чем в конформациях Е1 и Е2; а также, что глутатионилирование уменьшает количество доступных для протеолиза участков в Е1- и Е2Р-конформациях, по сравнению с неглутатионилированным белком. Полученные результаты свидетельствуют о том, что глутатионилирование влияет на конформацию фермента и его чувствительность к трипсинолизу. Приведены возможные механизмы увеличения чувствительности к трипсинолизу после изменения степени глутатионилирования фермента и связывания с ним уабаина, а также физиологическое значение этих феноменов.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: