Рекомбинантная продукция, реконструкция в липид-белковые нанодиски и электронная микроскопия полноразмерной α-субъединицы калиевого канала Kv7.1 человека

Аннотация

Потенциалозависимый калиевый канал Kv7.1 играет важную роль в возбудимости клеток сердечной мышцы. Основным структурным элементом этого канала является α-субъединица KCNQ1. При тетрамеризации KCNQ1 в мембране формируется ионный канал, включающий пору и четыре потенциалочувствительных домена. Мутации в гене KCNQ1 человека являются одной из основных причин наследственной аритмии – синдрома удлиненного интервала QT. В представленной работе получена синтетическая конструкция, кодирующая полноразмерный белок KCNQ1 человека, и разработана система его экспрессии в клетках дрожжей Pichia pastoris. Мембранную фракцию клеток дрожжей, содержавшую рекомбинантный белок (rKCNQ1), солюбилизировали с помощью детергента CHAPS. Для моделирования липидного окружения канала, близкого к природному, из солюбилизированной мембранной фракции получали липид-белковые нанодиски на основе белка MSP2N2. Нанодиски, содержавшие целевой белок, отделяли с помощью очистки на аффинной смоле, используя последовательность rho1D4, представленную на С-конце rKCNQ1. Схожим образом была проведена очистка препарата rKCNQ1, солюбилизированного в CHAPS. Полученные препараты изучали с помощью просвечивающей электронной микроскопии с негативным контрастированием. Анализ микрофотографий показал, что оба использованных подхода позволили получить гомогенные препараты rKCNQ1. Статистический анализ изображений индивидуальных частиц белка, солюбилизированного в детергенте, показал наличие тетрамерной структуры, свойственной природному каналу. Реконструированная с разрешением 2,5 нм трехмерная структура канала представляет собой компактную плотность с диаметром мембранной части ~9 нм и высотой ~11 нм. Анализ изображений Kv7.1 в нанодисках выявил наличие дополнительного пояса электронной плотности, соответствующего фрагменту липидного бислоя и белку MSP2N2. Полученные данные показывают, что нанодиски могут быть успешно использованы для выделения, очистки, стабилизации в растворе и дальнейших структурных исследований канала Kv7.1 человека.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: