Репортеры фермент-субстрат для оценки субстратной специфичности изоформ HIF-пролилгидроксилазы^*

Аннотация

Естественный ответ организма на гипоксию осуществляется за счет стабилизации фактора, индуцируемого гипоксией (HIF). Известны три изоформы субъединицы HIFα, стабильность которых регулируется тремя изоферментами HIF-пролилгидроксилазы (PHD1–3). Несмотря на интенсивные исследования субстратной специфичности с помощью измерения активности рекомбинантных изоформ фермента по отношению к трем изоформам HIF, не удается однозначно ответить на вопрос о предпочтительном субстрате для каждой изоформы фермента. В данной работе предлагается новый подход к решению проблемы субстратной специфичности, основанный на использовании клеточных репортеров, экспрессирующих пару, содержащую фермент и меченый люциферазой субстрат с одного вектора. Клетка в данном случае используется как биореактор для проведения и мониторинга реакции между оверэкспрессируемыми ферментом и субстратом. С помощью нового подхода удалось продемонстрировать, что HIF3 не является субстратом изоформы PHD3, что косвенно указывает на гидроксилирование второго пролина в последовательности 564PYIP567 (HIF1) под действием этой изоформы. Использование «парных» репортеров фермент–субстрат для оценки ингибиторного действия разветвленных оксихинолиновых ингибиторов HIF-пролилгидроксилазы позволяет с большей точностью выявить структурный мотив, оптимальный для ингибирования отдельных изоформ фермента.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: