БИОХИМИЯ, 2017, том 82, вып. 11, с. 1709–1717
УДК 577.171.53
Экспрессия в бесклеточной системе, очистка и характеристика функционального β2-адренорецептора для мультианалитической детекции β-агонистов
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: экспрессия в бесклеточной системе, β2-адренергический рецептор, оптимизация кодонов, очистка, β-агонист, рецептор-связывающий тест.
Аннотация
Высокоэффективная экспрессия β2-адренергического рецептора (β2-AR) в функциональной форме необходима для разработки тест-системы, предназначенной для детектирования разнообразных нелегально употребляемых агонистов β-адренорецепторов (β-агонистов). Гетерологичная экспрессия этого мембранного белка в клетках связана с рядом трудностей, такими как низкий выход и неправильный фолдинг полипептида. Для преодоления этих затруднений мы поставили своей целью получить большое количество функционального β2-AR в бесклеточной системе, основанной на экстрактах из Escherichia coli (E. coli). Ген β2-AR свиньи с оптимизированными кодонами (индекс адаптации кодонов, CAI = 0,96), адаптированный для экспрессии в E. coli, был синтезирован и экспрессирован в бесклеточной системе, что позволило получить белок в высокой концентрации 1,1 мг/мл. После очистки методом Ni-аффинной хроматографии биологическая активность очищенного рецептора была определена с помощью нового рецепторного теста с использованием связанного энзима (ELRA). Было установлено, что сродство очищенного β2-AR к β-агонистам убывало в ряду кленбутерол (CBL) > салбутамол (SAL) > рактопамин (RAC). При этом значения концентрации полумаксимального ингибирования (half maximal inhibitory concentration, IC50) составили 45,99, 60,8 и 78,02 мкг/л соответственно. Несмотря на то что активность полученного рецептора была немного ниже, чем у белка клеток насекомых и млекопитающих, разработанная система вполне позволяет получать β2-AR, который может быть использован при скрининге различных соединений для выявления β-агонистов.