БИОХИМИЯ, 2017, том 82, вып. 2, с. 309–322
УДК 577.35
Субстрат-специфичное восстановление солей тетразолия в изолированных митохондриях, тканях и лейкоцитах
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: нитро-синий тетразолий, метилтиазолилтетразолий, митохондрии, лейкоциты, стресс, прогестерон.
Аннотация
Соли тетразолия широко применяются в цитохимических и биохимических исследованиях как индикаторы метаболической активности клеток. Образующиеся при восстановлении тетразолиев формазаны при непродолжительном времени инкубации ведут себя как псевдорастворы, что позволяет измерять их оптическую плотность в процессе инкубации. В данной работе исследовали критерии и условия для измерения окислительной активности митохондрий и активности дегидрогеназ по восстановлению нитро-синего тетразолия (НСТ) и метилтиазолилтетразолия (МТТ) в суспензиях изолированных митохондрий, гомогенатов тканей и лейкоцитов. Показано, что восстановление этих акцепторов зависит от субстрата окисления, НСТ активнее восстанавливался при окислении сукцината, МТТ – при окислении NAD-зависимых субстратов. Восстановление обоих акцепторов более чувствительно к ингибиторам дегидрогеназ, чем к ингибиторам дыхательной цепи. При окислении сукцината восстановление НСТ в изолированных митохондриях, лейкоцитах в присутствии дигитонина и в гомогенатах печени и почки полностью блокировалось ингибиторами сукцинатдегидрогеназы – малонатом и ТТФА. Согласно этим критериям, выявлена активация окисления сукцината по увеличению малонат-чувствительной фракции восстановленного НСТ при физиологическом стрессе. С помощью МТТ исследовано влияние прогестерона и его синтетических аналогов на окисление NAD-зависимых субстратов в митохондриях. Оба акцептора восстанавливаются также супероксид анионом, вклад этой реакции несущественен или отсутствует при физиологических условиях, но может проявляться при генерации супероксида, индуцированной ингибиторами отдельных ферментных комплексов или при дисфункции митохондрий. Полученные результаты показывают, что измерение оптической плотности восстановленных НСТ и МТТ является высокочувствительным методом оценки метаболической активности митохондрий при разных условиях инкубации, обладает преимуществами по сравнению с другими методами (одновременная инкубация большого набора проб в спектральных кюветах или планшете) и, при наличии селективных ингибиторов, позволяет определять активность отдельных редокс-зависимых ферментов.