Функционирование Pma1 H⁺-АТРазы дрожжей при изменении заряда: роль остатков Аsp-739 и Аrg-811^*

Аннотация

В Pma1 H⁺-ATPазе плазматической мембраны дрожжей Saccharomyces cerevisiae имеется консервативный остаток Asp-739, находящийся на границе трансмембранного сегмента M6 и цитозоля, замена которого на Asn и Val (Petrov et al. (2000) J. Biol. Chem., 275, 15709–15716) или Ala (Miranda et al. (2011) Biochim. Biophys. Acta, 1808, 1781–1789) вызывала полное блокирование биогенеза мутантного фермента, не достигавшего секреторных везикул. Было предположено, что между этим остатком и находящимися рядом остатками с положительным зарядом может возникать сильная ионная связь с образованием солевого мостика, и замена D739A вызывала разрыв этой связи. Была построена гомологичная пространственная модель фермента, на основании которой было предположено, что таким стабилизующим остатком мог бы быть консервативный остаток Arg-811, расположенный в непосредственной близости от Asp-739. Для проверки этого предположения были использованы мутанты с единичными (D739V, D739N, D739A, D739R, R811L, R811M, R811A и R811D) и двойными заменами, нейтрализующими заряды остатков Asp-739 и Arg-811 (D739A/R811A) или меняющими их полярность (D739R/R811D). Уровень экспрессии АТРаз с точечными заменами R811А и R811D составлял 38–63%, а их активности – 29–30% от уровня дикого типа; гидролиз АТР и транспорт H⁺ у этих ферментов были существенно разобщены. В случае остальных замен, включая двойные, биогенез фермента был практически блокирован. Результаты подтверждают важную роль остатков Asp-739 и Arg-811 в биогенезе и функционировании фермента и предполагают их участие в определении детерминант транспорта H⁺, исключая, однако, наличие сильной ионной связи (солевого мостика) между ними и/или значение такой связи для структурно-функциональной организации Pma1 H⁺-АТРазы.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: