БИОХИМИЯ, 2016, том 81, вып. 4, с. 516–526
УДК 576.535
Использование библиотеки штрих-кодов для изучения отдела мезенхимных стволовых клеток
1 Гематологический научный центр Минздрава России, лаборатория физиологии кроветворения, электронная почта: bigildeev.ae@gmail.com
2 Research Department Cell and Gene Therapy, Department of Stem Cell Transplantation, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Germany
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: мезенхимные стволовые клетки (МСК), колониеобразующие единицы фибробластов (КОЕф), длительная культура костного мозга (ДККМ), лентивирусная библиотека штрих-кодов, LeGO векторы.
Аннотация
Cтромальное микроокружение костного мозга, поддерживающее кроветворение, формируется за счет пролиферации и дифференцировки мезенхимных стволовых клеток (МСК). Отдел МСК существенно менее изучен, чем отдел стволовых кроветворных клеток (СКК). Для того, чтобы охарактеризовать структуру отдела МСК, необходимо проследить за судьбой отдельных мезенхимных клеток, т.е. провести их индивидуальное маркирование. Последние 10 лет активно развивается подход индивидуального маркирования нормальных и опухолевых стволовых клеток, основанный на использовании генетических штрих-кодов. Для МСК такой подход не применяли. В данной работе была исследована возможность использования стратегии, основанной на применении штрих-кодированной библиотеки лентивирусов, для маркирования МСК и их потомков – колониеобразующих единиц фибробластов (КОЕф). Подслои прилипающих клеток (ППК) из длительных культур костного мозга (ДККМ) мышей инфицировали лентивирусной библиотекой, содержащей штрих-коды, состоящие из 32 + 3 вырожденных нуклеотидов. Инфицированные ППК суспендировали и клонировали для получения колоний из КОЕф. Из каждой колонии в отдельности выделяли ДНК и анализировали штрих-коды в маркированных колониях с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенирования по Сэнгеру. Штрих-коды были установлены для 154 маркированных колоний, все они оказались уникальными: не было обнаружено двух колоний, которые бы содержали один и тот же штрих-код. Было установлено, что в ППК содержатся КОЕф, различающиеся по пролиферативному потенциалу. В иерархии предшественников МСК находятся выше КОЕф и полученные данные указывают на то, что МСК являются редко делящимися клетками в ДККМ. Разработан метод стабильного индивидуального маркирования и сравнения маркеров в мезенхимных клетках предшественниках. Впервые показано, что штрих-кодированная библиотека лентивекторов является эффективным инструментом для изучения стромальных клеток-предшественников.