БИОХИМИЯ, 2016, том 81, вып. 2, с. 265–281
УДК 577.152.3
Влияние эндонуклеазы G на стабильность экзогенной ДНК в клетках HeLa
1 Department of Biological Sciences, Brock University, 500 Glenridge Avenue, St. Catharines, ON, L2S 3A1, Canada; E-mail: vanjamisic.bu@gmail.com
2 Molecular Biology Department, National Research Centre, 33 El-Bohouth St., Dokki, Giza, Egypt, P.O. 12622
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: EndoG, клетки HeLa, плазмиды, shРНК, сайленсинг, трансфекция.
Аннотация
Эндонуклеаза G (EndoG) – это высоко консервативная митохондриально-ядерная нуклеаза, играющая как летальную, так и жизненно важную роль в клетке. Целью данной работы явилась проверка, проявляет ли EndoG свою нуклеазную активность по отношению к ДНК-субстрату, такому как экзогенная плазмидная ДНК (рДНК), с точки зрения выяснения важности этого фермента для использования в генной терапии. Изучено влияние «нокдауна» EndoG на стабильность рДНК и экспрессию кодируемого ею репортерного гена зеленого флуоресцирующего белка (GFP) при использовании клеток карциномы шейки матки человека линии HeLa. Показано, что после трансфекции в клетки HeLa векторных рДНК, кодирующих специфические короткие шпилечные РНК (shРНК), наблюдалось снижение уровней EndoG мРНК внутри этих клеток. В физиологических условиях такой «нокдаун» EndoG не влиял ни на стабильность рДНК, ни на уровни экспрессии кодируемого ею репортерного гена в течение четырех дней наблюдения. Но, если экспрессия эндогенной EndoG увеличивалась благодаря влиянию внешних факторов, «нокдаун» EndoG под действием специфичных shРНК повышал как стабильность, так и трансгенную экспрессию векторных рДНК. Таким образом, EndoG не опосредует специфическое разрушение именно экзогенной ДНК, однако в нефизиологических условиях этот фермент может расщеплять внутриклеточную ДНК неспецифически и независимо от ее источника. Мы не считаем, что блокирование EndoG является подходящей стратегией для увеличения уровня и продолжительности кратковременной экспрессии трансгенов, переносимых невирусными векторными ДНК, используемыми в генной терапии.