БИОХИМИЯ, 2016, том 81, вып. 2, с. 251–264
УДК 577.214
Анализ EST, идентификация генов гусеобразных, кодирующих трипсин, на основе библиотеки полной последовательности кДНК утки (Anas platyrhynchos) и их структурно-функциональная характеристика
1 Даляньский технологический университет, Институт биотехнологии моря, Факультет наук о жизни, Далянь, Ляонинг, 116024 Китай; электронная почта: joannyu@live.cn
2 Университет Сучоу, Колледж фармацевтических наук, Сужоу, Джянгсу, 215123 Китай; факс: 86-411-84708850, электронная почта: yipengwang@suda.edu.cn
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: аnseriformes, Anas platyrhynchos, трипсин, клонирование молекул, экспрессия, структура и функция.
Аннотация
Трипсины представляют собой ключевые белки, участвующие в процессах переваривания белков в клетках животных путем разрушения пептидных связей, образованных карбоксильной группой остатков лизина и аргинина. Они широко используются в различных биотехнологических процессах. В настоящей работе была создана библиотека полноцепочечных кДНК с емкостью 5 × 105 cfu/мл из утки (Anas platyrhynchos). Гены, кодирующие трипсин, идентифицированы путем секвенирования EST и затем с помощью RACE-ПЦР были получены две полноцепочечные кДНК, которые, как показано, кодируют сигнальный пептид, активационный пептид и зрелый белок, состоящий из 223 аминокислотных остатков. Два зрелых белка, чья аминокислотная последовательность была предсказана на основе кДНК, были обозначены как трипсин-IAP и трипсин-IIAP, и теоретические значения их изоэлектрических точек (pI) и молекулярного веса (MW) были равны 7,99/23466,4 дальтон и 4,65/24066,0 дальтон соответственно. Гены трипсина также были детально охарактеризованы с помощью методов биоинформатического анализа. В результате филогенетического анализа было показано, что трипсин-IIAP имел определенное преимущество перед трипсином-IAP. Затем трипсин-IIAP утки был экспрессирован в Escherichia coli и были определены его кинетические параметры. С помощью моделирования по гомологии были предсказаны трехмерные структуры трипсин-IAP и трипсин-IIAP и определены консервативные аминокислотные остатки, определяющие функциональные свойства этих белков. Обнаружено, что две петли, контролирующие специфичность действия трипсина, и субстратсвязывающий карман почти идентичны по первичной последовательности и пространственной структуре в семействах трипсинов.