БИОХИМИЯ, 2016, том 81, вып. 1, с. 122–134
УДК 577.151
Рекомбинантная фосфолипаза А1 из наружной мембраны психротрофной бактерии Yersinia pseudotuberculosis: экспрессия, очистка, характеристика
1 Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, 690022 Владивосток; факс: +7(423)231-4050, электронная почта: sibakh@mail.ru
2 Дальневосточный федеральный университет, Школа биомедицины, 690950 Владивосток; факс: +7(423)245-7687
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: Yersinia pseudotuberculosis, фосфолипаза А1, рекомбинантный белок, компьютерное моделирование пространственной структуры.
Аннотация
Ген pldA, кодирующий мембраносвязанную фосфолипазу А1 (rPldA) Yersinia pseudotuberculosis, был клонирован и экспрессирован в Escherichia сoli. Рекомбинантная rPldA была выделена из телец включения, растворенных в присутствии 8 М мочевины, с помощью двухстадийной хроматографии (ионообменная хроматография, гель-фильтрация) в виде неактивного мономера. Методом масс-спектрометрии установлена молекулярная масса rPldA (31,7 ± 0,4 кДа). Высокоочищенная rPldA была ренатурирована инкубацией в течение 16 ч при комнатной температуре после 10-кратного разбавления буфером, содержавшим 10 мМ тритон Х-100. В присутствии Са2+ ренатурированная rPldA гидролизовала 1,2-диолеил-sn-глицеро-3/фосфатидилхолин. Максимальная активность фермента наблюдалась при 37° и около 40% активности – при 15°. Установлено, что rPldA активна в широком диапазоне рН (от 4 до 11) с оптимумом при рН 10. Получены модели пространственной структуры мономера и димера rPldA, установлены функционально важные аминокислотные остатки фермента и выявлены структурные различия с фосфолипазой А1 E. coli, которые могут определять функциональные особенности фосфолипазы А1 Y. pseudotuberculosis.