БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 10, с. 1542–1550
УДК 577.214
Выделение и характеристика рекомбинантной РНК-полимеразы Deinococcus radiodurans
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: Deinococcus radiodurans, экспрессия белков, РНК-полимераза, расщепление РНК.
Аннотация
Радиорезистентная бактерия Deinococcus radiodurans является одной из самых интересных моделей для изучения стрессоустойчивости клеток. Исследования механизмов регуляции экспрессии генов у D. radiodurans выявили ряд особенностей транскрипционного аппарата, которые могут играть роль в устойчивости клеток к ДНК-повреждающим воздействиям. В частности, РНК-полимераза D. radiodurans образует нестабильные промоторные комплексы, а на стадии элонгации транскрипции способна с гораздо большей скоростью расщеплять РНК-транскрипт, чем РНК-полимераза Escherichia coli. Исследования структуры и функций РНК-полимеразы D. radiodurans затруднены в связи с отсутствием удобной генетической системы для получения мутаций в генах РНК-полимеразы и сложностью выделения фермента. В данной работе создана система для экспрессии РНК-полимеразы D. radiodurans в клетках E. coli. Получен экспрессионный вектор, содержащий гены всех субъединиц кор-фермента данной РНК-полимеразы, подобраны условия экспрессии и выделения белка, свободного от примесей. Установлено, что РНК-полимераза D. radiodurans обладает повышенной скоростью расщепления РНК по сравнению с ферментом E. coli в широком диапазоне условий, в т.ч. при различных концентрациях ионов магния и рН реакционного буфера. Разработанная экспрессионная система может быть использована для изучения особенностей реакции расщепления РНК и механизмов регуляции транскрипции у D. radiodurans, в т.ч. с использованием мутантных вариантов РНК-полимеразы.