БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 7, с. 1109–1118
УДК 577.114
Высокоэффективный гликомный анализ: оптимизация пробоподготовки
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: плазма крови, гликаны, гликомный анализ, HILIC, UPLC.
Аннотация
Известно, что гликозилирование влияет на структуру, фолдинг и функцию множества белков, а нарушения гликозилирования связаны с различными заболеваниями. Разработано множество методов анализа гликанов в составе иммуноглобулинов (в основном IgG), однако анализ гликанов суммарных белков плазмы крови развит гораздо меньше из-за дополнительных проблем, возникающих вследствие большей сложности образца. В настоящей работе мы описываем разработку и оптимизацию высокоэффективного метода пробоподготовки для анализа N-гликанов белков плазмы с помощью разновидности жидкостной хроматографии HILIC в ее сверхвысокоэффективном варианте (HILIC–UPLC). Было показано, что основным источником вариативности является стадия очистки меченых гликанов; для лучшей воспроизводимости мы протестировали целлюлозу, силикагель, биогель и гидрофильный GHP-фильтр в качестве неподвижной фазы для твердофазной экстракции. Было показано, что все они подходят для очистки меченых гликанов, однако метод с использованием планшетного фильтра GHP и холодного 96%-ного ACN более удобен и обеспечивает наиболее высокую воспроизводимость. Метод был дополнительно оптимизирован с использованием скрининга Плакетта–Бермана и валидирован в отношении анализа вариативности основных шагов, а также вариативности по дням и исполнителям. Разработанный метод является быстрым, экономичным и удобным в использовании, обладает хорошей воспроизводимостью и позволяет оценивать разнообразие N-гликома плазмы стабильно на протяжении длительных периодов времени.