Роль петли L5–6, соединяющей мембранные сегменты M5 и M6, в биогенезе и функционировании Pma1 H⁺-ATPазы дрожжей

Аннотация

Экстрацитозольная петля L5–6 (714-DNSLDID) соединяет трансмембранные сегменты M5 и M6, вместе с сегментами M4 и M8 образующие сайты транспорта катионов в H⁺-, Ca²⁺-, K⁺,Na⁺-, Н⁺,К⁺– и других P2-ATPазах. Для изучения структурно-функциональной организации Pma1 H⁺-ATPазы плазматической мембраны дрожжей использовали аланин- и цистеин-сканирующий мутагенез. Замены на Ala и Cys наиболее консервативного остатка (Leu-717) вызывали полное блокирование биогенеза фермента, который не достигал секреторных везикул. Замена D714A приводила к уменьшению экспрессии фермента в 5 раз и потере его активности, замена D714C полностью блокировала биогенез фермента. Замены остальных аминокислотных остатков не приводили к потере активности фермента. Были произведены дополнительные замены Asp-714 и Asp-720 на Asn и Glu. Из замен остатка Asp-714 только D714N частично восстанавливала биогенез мутантного фермента и его функционирование; в то же время все мутации, полученные для Asp-720, обладали значительной экспрессией и были активны. Экспрессированные мутантные ферменты (34–95% от уровня дикого типа) обладали значительной активностью (35–108%) и были пригодны для детального анализа. У одного из этих мутантов (I719A) наблюдали трехкратное уменьшение экспрессии, активности и транспорта H⁺ и его сопряжения с гидролизом ATP, однако замена I719C мало отличалась от дикого типа. Таким образом, в двух случаях из семи замены на Ala и Cys серьезно нарушали биогенез и/или функционирование фермента. Результаты позволяют предположить важную роль аминокислотных остатков, образующих петлю L5–6, отвечающую, видимо, за правильное расположение трансмембранных сегментов M5 и M6 и других доменов Pma1 H⁺-АТРазы, в биогенезе и функционировании фермента и, возможно, участвующую в его регуляции.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: