БИОХИМИЯ, 2014, том 79, вып. 7, с. 845–863
УДК 577.124
Структурно-функциональное исследование связывания лигандов семейством 35 углевод-связывающего модуля (CtCBM35) β-маннаназы семейства 26 гликозидгидролазы из Clostridium thermocellum
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: CtCBM35, моделирование по гомологии, докинг, КД-спектры, аффинный электрофорез, спектры флуоресценции, переход в развернутое состояние.
Аннотация
Функциональные свойства рекомбинантного углевод-связывающего модуля CBM35 семейства 35 β-маннаназы из семейства 26 гликозидгидролазы Clostridium thermocellum были рассчитаны с помощью биохимических и in silico подходов. Лиганд-связывающие свойства экспрессированного CtCBM35 были проанализированы с помощью аффинного гель-электрофореза и флуоресцентной спектроскопии, были определены константы ассоциации Ka ~1,2 · 105 и 3,0 · 105 M–1 для галактоманнана из бобов робинии (лжеакации) и маннотриозы соответственно. Однако CtCBM35 продемонстрировал низкую лиганд-связывающую активность в отношении нерастворимого маннана слонового ореха с Ka = 5,0 · 10–5 M–1. Переход в развернутое состояние был проанализирован с помощью флуоресцентной спектроскопии и объяснял конформационные изменения, происходящие в CtCBM35 в присутствии 5 M гуанидин гидрохлорида и 6,25 M мочевины. Эти результаты объяснили тот факт, что CtCBM35 обладает хорошей конформационной стабильностью, и для его развертывания требуется больше свободной энергии денатурации. Трехмерная (3D) модель CtCBM35 из C. thermocellum, генерированная с помощью Modeller9v8, показала доминирование β-складчатых структур, располагающихся в виде рулета джема. Вторичная структура CtCBM35, определенная при использовании PredictProtein, содержала две α-спирали (3%), 12 β-складчатых структур (45%) и 15 случайных клубков (52%). Анализ элементов вторичной структуры клонированного, экспрессированного и очищенного рекомбинатного CtCBM35 с помощью кругового дихроизма также подтвердили предсказанную in silico вторичную структуру. Множественное выравнивание последовательностей CtCBM35 выявило консервативные остатки (Tyr123, Gly124 и Phe125), которые обычно присутствуют в маннан-специфичных CBMs. Докинг CtCBM35 маннополисахаридами выявил участие аминокислотных остатков Tyr26, Gln29, Asn43, Trp66, Tyr68, Leu69, Arg76 и Leu127, образующих полярные контакты с молекулами лигандов. Анализ результатов докинга лигандов модулем CtCBM35 показал его более высокую связывающую активность в отношении маннотриозы и галактоманнана (Man–Gal–Man-компонент), обосновал результаты по аффинному связыванию и флуоресценции, показывая сходные значения Ka.