Мультиплексная ПЦР для совместной амплификации генов бактериальных ферментов карбапенемаз молекулярных классов A, B и D

Аннотация

Представлен метод совместной амплификации генов бактериальных ферментов карбапенемаз молекулярных классов A, B и D для гибридизационного анализа на ДНК-микрочипах. Использование ДНК-полимеразы нового поколения KAPA2G Fast («KAPA Biosystems», США) и оптимизация условий мультиплексной ПЦР с 20 парами праймеров позволили проводить совместную амплификацию полноразмерных генов карбапенемаз семи различных типов (KPC, VIM, IMP, SPM, SIM, GIM и OXA) с одновременным включением в них биотина в качестве метки. При этом выход меченого ПЦР-продукта, достаточный для дальнейшего гибридизационного анализа на микрочипе, достигался уже через 40 мин после начала реакции. Это позволило сократить общую продолжительность метода идентификации ДНК, включая стадию пробоподготовки, до 4 ч. Метод идентификации генов на ДНК-микрочипах с усовершенствованной стадией амплификации специфических генов карбапенемаз был апробирован на клинических штаммах грамотрицательных микроорганизмов Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii и Enterobacteriaceae spp. с различной чувствительностью к действию карбапенемов по данным фенотипирования. У всех клинических штаммов Acinetobacter baumannii, резистентных к карбапенемам, были обнаружены гены карбапенемаз ОХА-типа (субтипы ОХА-51, ОХА-23, ОХА-40, ОХА-58), у резистентных к карбапенемам клинических штаммов Pseudomonas aeruginosa – ген металло-бета-лактамазы VIM типа (субтип VIM-2). При тестировании клинических штаммов, чувствительных к карбапенемам, гены карбапенемаз обнаружены не были. Таким образом, метод идентификации генов карбапенемаз на ДНК-микрочипах характеризуется хорошей точностью и может быть использован в клинических микробиологических лабораториях для экспресс-диагностики резистентности, вызванной продукцией карбапенемаз.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: