БИОХИМИЯ, 2014, том 79, вып. 6, с. 675–683
УДК 577.152
Единственный дисульфидный мостик в молекуле термофильной ксиланазы SYXYN11 играет решающую роль в ее термостабильности
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: ксиланаза, термостабильность, дисульфидный мостик, направленный сайт-специфический мутагенез.
Аннотация
На основе известной структуры генной последовательности (EU591743) высокотермостабильной ксиланазы EvXyn11TS из семейства 11, синтезировали ген Syxyn11, кодирующий термофильную ксиланазу SyXyn11 и несущий синонимические кодоны, характерные для дрожжей Pichia pastoris. Анализ результатов гомологического выравнивания аминокислотных последовательностей различных ксиланаз из семейства 11 показал, что только фермент SyXyn11 содержал дисульфидный мостик Cys5–Cys32 в своей N-концевой части. Это могло свидетельствовать о важности вклада N-концевого дисульфидной связи в термостабильность этого фермента. Для подтверждения такого предположения ген Syxyn11 был подвергнут направленной сайт-специфической мутации, приводящей к созданию гена Syxyn11С5Т и соответственно к точечной замене Cys5→Thr в кодируемом белке SyXyn11C5T. Затем обе рекомбинантные ксиланазы (reSyXyn11 и reSyXyn11C5T) были экспрессированы в клетках дрожжей P. pastoris GS115 с выходом около 35 ед/мл суспензионной культуры и очищены до гомогенного состояния; их специфические активности составили 363 и 344 ед/мг белка соответственно. Оптимальная температура для реакции катализа составляла 85 и 70°, а термостабильность – 80 и 50° для рекомбинантных ферментов reSyXyn11 и reSyXyn11C5T соответственно. Заметных различий в оптимальных значениях рН и рН-стабильности у обоих ферментов не наблюдали.