БИОХИМИЯ, 2013, том 78, вып. 10, с. 1422–1435
УДК 577.152.24
Повышение эффективности реакции трансгликозилирования, катализируемой альфа-галактозидазой из Thermotoga maritima, методами белковой инженерии
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: α-D-галактозидаза, трансгликозилирование, ферментативный синтез pNP дигалактозидов.
Аннотация
При высоких концентрациях субстрата гидролиз пара-нитрофенил α-D-галактопиранозида (pNPGal) α-D-галактозидазой из Thermotoga maritima (TmГалА) сопровождается трансгликозилированием с образованием смеси (α1,2)-, (α1,3)- и (α1,6)-пара-нитрофенил (pNP) дигалактозидов. Молекулярное моделирование стадии реакции, предшествующей синтезу pNP дигалактозидов в активном центре фермента, привело к обнаружению аминокислотных остатков, модификация которых потенциально может увеличить эффективность реакции трансгликозилирования. После сайт-направленного мутагенеза предсказанного набора замен аминокислотных остатков гены фермента дикого типа и мутантных форм TmГалА были экспрессированы в клетках E. coli, а соответствующие ферменты выделены и проверены в синтезе различных pNP дигалактозидов. Было показано, что у трех мутантов, F328A, P402D и G385L, заметно увеличилась общая трансгликозилирующая активность по сравнению с ферментом дикого типа. Кроме того, мутант F328A оказался способным к образованию региоизомера со связью (α1,2)- с выходом в 16 раз большим по сравнению с TmГалА дикого типа.