Направленная искусственная эволюция атразинхлоргидролазы и характеристика мутантных форм фермента, обладающих повышенной каталитической активностью

Аннотация

Атразинхлоргидролаза (AtzA, EC 3.8.1.8) привлекла внимание в связи с тем, что катализирует превращение ядовитого атразина в малотоксичный гидроксиатразин и может быть использована для биодеградации этого гербицида. Для поиска удачных разновидностей гена аtzA в библиотеке случайных мутантов был применен метод селекции клонов, основанный на использовании одноклеточной водоросли Haematococcus pluvialis. В результате были получены восемь мутантных разновидностей фермента, обладающих повышенной каталитической активностью, превышающей активность AtzA «дикого» типа в 2,7–5 раз. Секвенирование показало, что две из этих активных форм содержали единичные точечные замены остатков Val12 и Leu395 соответственно. Другие усовершенствованные мутантные формы фермента несли замены одновременно в четырех аминокислотных остатках: Met315, His399, Asn429 и Val466, что свидетельствовало о важности всех шести остатков для активности AtzA. Анализ кинетики хлоргидролазной реакции показал, что пять мутантных разновидностей фермента имели K_m в 0,6–0,9 раз меньшую, а каталитическая эффективность (k_cat/K_m) у всех восьми мутантных форм была в 2,5–4,1 раз более высокой по сравнению с «дикой» формой атразинхлоргидролазы. Моделирование трехмерной третичной структуры молекулы показало, что AtzA содержит домен (β/α)₈, характерный для надсемейства амидогидролаз, а также домен, состоящий из двух связанных между собой параллельных β-слоев. Ион железа и пять взаимодействующих с ним аминокислотных остатков были локализованы в центральном β-барреле домена (β/α)₈. Некоторые из вышеупомянутых аминокислотных остатков участвовали в формировании водородных связей внутри β-слоя, соседствующего с доменом (β/α)₈.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: