БИОХИМИЯ, 2013, том 78, вып. 8, с. 1215–1221
УДК 577.152.34
Сигнальная пептидаза Escherichia coli способна узнавать и расщеплять сигнальную аминокислотную последовательность рекомбинантной α-амилазы из Bacillus licheniformis
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: α-амилаза, Bacillus licheniformis, сигнальный пептид.
Аннотация
Ген α-амилазы из Bacillus licheniformis и его гомолог, не кодирующий сигнальную аминокислотную последовательность, были клонированы и экспрессированы в компетентных клетках Escherichia coli. Продуцируемые E. coli рекомбинантные белки располагались в цитоплазме клеток-продуцентов в виде нерастворимых, но ферментативно активных цитоплазматических агрегатов. Экспрессия при низкой концентрации индуктора (0,01 мМ изопропил β-D-тиогалактопиранозид вместо 0,5 мМ) и при пониженной температуре (18° вместо 37°) приводила к продукции значительных количеств растворимого рекомбинантного фермента, находящегося в растворимом состоянии и расположенного во внеклеточной среде. Рекомбинантный белок, несущий сигнальную последовательность, в отличие от своего гомолога, не содержащего этой аминокислотной последовательности, мог экспортироваться из клеток-продуцентов во внешнюю среду. При этом, активность α-амилазы в культуральной среде нарастала постепенно во времени с начала индукции экспрессии. Методом масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS), а также путем определения N-концевой последовательности очищенной рекомбинантной α-амилазы было установлено, что сигнальная пептидаза E. coli расщепляет сигнальную последовательность между остатками Ala28 и Ala29 фермента-предшественника. Предполагается, что сигнальный пептид α-амилазы из B. licheniformis можно использовать для секреции различных рекомбинантных белков, которые экспрессируются и продуцируются с помощью E. coli.