БИОХИМИЯ, 2013, том 78, вып. 8, с. 1178–1186
УДК 577.152.3.
Модуляция ферментативной активности нуклеозидтрифосфатазы/хеликазы неструктурного белка NS3 вируса лихорадки денге под воздействием поли(U)
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: вирус лихорадки денге, белок NS3, НТРаза, хеликаза.
Аннотация
Неструктурный белок 3 (NS3) флавивирусов обладает ферментативными активностями, играющими ключевую роль в репликации этих вирусов, и может служить наиболее подходящей мишенью для противовирусной терапии. NS3 вируса лихорадки денге типа 2 (DEN2) состоит из двух доменов: N-концевого (NS3pro), являющегося сериновой протеазой и С-концевого (NS3h), обладающего активностью фермента, названного РНК-зависимой нуклеозидтрифосфатазой (НТРаза)/РНК-хеликазой. В представленной работе создана с помощью ПЦР плазмида, несущая хеликазный домен (NS3h) белка NS3 вируса DEN2. Рекомбинантный белок NS3h (Mr 56,5 кДа) был очищен методом металлаффинной хроматографии в денатурирующих условиях, а затем ренатурирован в присутствии искусственных шаперонов с получением активной хеликазы. Активность НТР гидролазы белка NS3 определяли с использованием малахитового зеленого. Установлено, что в присутствии поли(U) эта активность повышалась в ~4 раза; при этом увеличивалось число оборотов фермента (kcat) в то время как снижалась Km. Активность хеликазы определяли по изменению собственной флуоресценции коротких олигодезоксирибонуклеотидных искусственных субстратов. Показано, что в отсутствие полинуклеотидов, таких как поли(U), наблюдалось значительное увеличение флуоресценции искусственного субстрата под действием хеликазы. Добавление поли(U) приводило к подавлению способности хеликазы расплетать цепи ДНК. Описанный нами подход может быть использован для дальнейшей характеристики субстратной специфичности хеликазы, а также для разработки высокопроизводительного метода тестирования активностей НТРазы/хеликазы с целью поиска соответствующих специфических ингибиторов.