БИОХИМИЯ, 2013, том 78, вып. 8, с. 1171–1177
УДК 577.152.3
Экспрессия, очистка, ренатурация и изучение свойств рекомбинантной протеазы NS2B(H)-NS3pro вируса лихорадки денге
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: вирус лихорадки денге, протеаза NS2B(H)-NS3pro, очистка, характеристика, субстраты.
Аннотация
Вирус лихорадки денге (DEN) угрожает ≈2,5 млрд человек во всем мире; ≈50 млн. инфицируются ежегодно, и пока еще нет ни вакцин, ни лекарств от этой вирусной инфекции. Протеазный комплекс NS2B-NS3pro необходим для репликации флавивирусов и может служить в качестве мишени для противовирусных лекарственных препаратов. Целью нашего исследования являлась разработка сравнительно несложных экспериментальных стратегических подходов для конструирования, очистки и анализа высокоактивного рекомбинантного протеазного комплекса NS2B(Н)-NS3pro, который мог бы быть в дальнейшем использован для эффективного поиска его потенциальных ингибиторов. Нуклеотидная последовательность NS2B(Н)-NS3pro была сконструирована методом SOE (сплайсинг путем удлинения с частичным перекрыванием матриц)-ПЦР и переклонирована в вектор pTrcHisA. Рекомбинантный протеиновый комплекс NS2B(Н)-NS3pro, несущий N-концевую гексагистидиновую метку (His6), был экспрессирован в E. coli преимущественно в нерастворимой форме и получен с чистотой более чем 95% в одну стадию методом металлаффинной хроматографии. Анализ методом Ds-Na-ПААГ-ЭФ и иммуноблоттинга показал, что в полученном препарате присутствовал белок-предшественник NS2B(Н)-NS3pro и продукты его аутопротеолиза белки NS3pro и NS2B(H) с Mr 37, 21 и 10 кДа соответственно. Кинетические параметры протеазной реакции Km, kcat и kcat/Km, определенные с использованием флуорогенного модельного субстрата Ac-nKRR-amc (ацетил-Nle-Lys-Arg-Arg-7-амино-4-метилкумарин), составили 100 мкМ, 0,112 с–1 и 1125 M–1 с–1 соответственно. В результате несложной процедуры клонирования, экспрессии и очистки был получен обладающий высокой протеазной активностью рекомбинантный гибридный белковый комплекс NS2B(Н)-NS3pro, который может быть использован для поиска специфических ингибиторов, обладающих антифлавивирусной активностью.