Структурные исследования рекомбинантного ростового домена урокиназы

Аннотация

Активатор плазминогена урокиназного типа (uPA) является сериновой протеазой, которая переводит профермент плазминоген в протеолитически активную форму плазмин. Урокиназа синтезируется и секретируется в виде одноцепочечной молекулы, состоящей из N-концевого домена (GFD), крингл-домена (KD) и C-концевого протеолитического домена (PD). Структура ATF (фрагмент урокиназы, состоящий из GFD и KD) в свободном состоянии и в комплексе с рецептором урокиназы (uPAR, CD87), лишенным ГФИ-якоря, была изучена ранее методами ЯМР (Hansen et al., 1994) и рентгеноструктурного анализа (Barinka et al., 2006). Согласно полученным данным, в структуре GFD выделяют две области, состоящие из β-слоев, ориентированных перпендикулярно друг к другу. GFD-область, отвечающая за связывание с uPAR, расположена в подвижной Ω-петле, состоящей из семи аминокислотных остатков и соединяющей два тяжа антипараллельного β-слоя. Методом точечного мутагенеза было показано, что укорачивание Ω-петли на одну аминокислоту приводит к неспособности GFD взаимодействовать с uPAR (Magdolen et al., 1996). В отличие от вышеупомянутых данных, мы не получили каких-либо признаков наличия участков β-слоев в GFD в полученных нами образцах uPA как в свободном состоянии, так и в комплексе с uPAR. GFD представляется достаточно гибким и неструктурированным доменом, способным, тем не менее, к высокоспецифичному взаимодействию с uPAR как in vitro, так и в экспериментах с клеточными культурами. Для оценки вторичной структуры GFD урокиназы мы использовали круговой дихроизм, изменение флюоресценции триптофана при температурной денатурации белка и гетероядерную ЯМР-спектроскопию ATF, меченного ¹⁵N и ¹³C, в свободном состоянии и в комплексе с uPAR.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: