БИОХИМИЯ, 2013, том 78, вып. 4, с. 501–512
УДК 577.311
Характеристика холодоактивной липазы Psychrobacter cryohalolentis K5T и ее делеционных мутантов
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: криопэг, вечная мерзлота, Psychrobacter cryohalolentis, холодоактивная липаза, термостабильность, делеционные мутанты.
Аннотация
Проведены клонирование и экспрессия в Escherichia coli гена холодоактивной липазы психротрофной бактерии Psychrobacter cryohalolentis K5T, выделенной из криопэга Колымской низменности. Рекомбинантный белок Lip1Pc, содержащий шесть остатков гистидина на С-конце, очищен с помощью Ni-аффинной хроматографии. Фермент проявляет максимальную липолитическую активность при 25° и рН 8,0 с использованием p-нитрофенилдодеканоата (C12) в качестве субстрата. Повышение температуры выше 40° и добавление различных ионов металлов и органических растворителей подавляют ферментативную активность Lip1Pc. Большинство неионных детергентов, таких как Triton Х-100 и Тween-20 увеличивают активность липазы, в то время как додецилсульфат натрия полностью ингибирует ее. Для исследования функциональной роли N-концевого домена Lip1Pc сконструированы пять делеционных мутантов этого белка. Установлено, что мутанты ND1 и ND2 обладали пониженной на 30–35% удельной активностью, в то время как остальные варианты были полностью неактивны. Оба мутанта показали увеличение активности по отношению к p-нитрофенилдеканоату (С10) и снижение способности утилизировать p-нитрофенилпальмитат (С16). Температурный оптимум активности мутанта ND2 понизился до 20°, однако его стабильность после прогревания при 40° оказалась на 44% выше, чем у Lip1Pc. Полученные результаты доказывают, что N-концевой домен Lip1Pc имеет фундаментальное значение для активности белка и его термостабильности.