БИОХИМИЯ, 2020, том 85, вып. 6, с. 840–848

УДК 577.152.321:577.114.4:57.083.13

Создание продуцента хитиназы и использование её препарата для разрушения клеточной стенки микроскопических грибов

© 2020 О.А. Синицына 1*, Е.А. Рубцова 2, И.Г. Синельников 2, Д.О. Осипов 2, А.М. Рожкова 2, В.Ю. Матыс 3, Т.В. Бубнова 3, В.А. Немашкалов 3, А.С. Середа 4, Л.А. Щербакова 5, А.П. Синицын 1,2

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультет, 119991 Москва, Россия; электронная почта: oasinitsyna@gmail.com

ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, 119071 Москва, Россия

ФИЦ Пущинский научный центр биологических исследований РАН, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, 142290 Пущино, Московская обл., Россия

ВНИИ пищевой биотехнологии филиала ФИЦ питания, биотехнологии и безопасности пищи, 111033 Москва, Россия

Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии, 143050 Большие Вязёмы Московской обл., Россия

Поступила в редакцию 16.04.2020
После доработки 18.04.2020
Принята к публикации 18.04.2020

DOI: 10.31857/S0320972520060093

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: хитиназа, хитин, хитозан, Penicillium verruculosum, фитопатогенные грибы, биоконверсия отходов.

Аннотация

На основе гриба Penicillium verruculosum создан рекомбинантный штамм, комплекс внеклеточных ферментов которого содержит хитиназу Myceliophtora thermophila. Активность ферментных препаратов, полученных из культуральной жидкости штамма-продуцента, достигала 0,55, 0,53 и 0,66 ед/мг белка по хитину и хитозанам с мол. массой 200 и 1000 кДа соответственно. Оптимумы температуры и рН рекомбинантной хитиназы составили 52–65 °С и рН 4,5–6,2, что соответствует литературным данным для ферментов этого класса. Содержание гетерологичной хитиназы в исследованных ферментных препаратах составило 47% от общего содержания белка в культуральной жидкости. Показано, что новые ферментные препараты, полученные на основе рекомбинантного штамма Penicillium verruculosum ХТ403 и содержащие гетерологичную хитиназу, способны разрушать мицелий микроскопических, в том числе фитопатогенных грибов, и весьма эффективны в процессах биоконверсии отходов микробиологической промышленности.

Сноски

* Адресат для корреспонденции.

Финансирование

Работа выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования (уникальный идентификатор проекта: RFMEFI61620X0128).

Благодарности

В работе использовали оборудование Центра коллективного пользования «Промышленные биотехнологии» ФИЦ Биотехнологии РАН.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в финансовой или какой-либо иной сфере.

Соблюдение этических норм

Настоящая статья не содержит описания выполненных авторами исследований с участием людей или использованием животных в качестве объектов.

Список литературы

1. Мелентьев А. И., Актуганов Г. Э. (2013) В кн. Ферменты деградации хитина и хитозана. Хитозан (под ред.Г. К. Скрябина, С. Н. Михайлова, В. П. Варламова), центр «Биоинженерия» РАН, Москва, с. 71-114.

2. Chitin, Chitosan, Oligosaccharides and Their Derivatives: Biological Activity and Applications (2011) (Kim, S.-K., ed.) CRC Press, Taylor and Francis Group, Boca Raton, London, N. Y., doi: 10.1201/EBK1439816035.

3. Berini, F., Katz, C., Gruzdev, N., Casartelli, M., Tettamanti, G., and Marinelli, F. (2018) Microbial and viral chitinases: attractive biopesticides for integrated pest management, Biotechnol. Adv., 36, 818-828, doi: 10.1016/j.biotechadv.2018.01.002.

4. Vijayakumar, N., and Alagar, S. (2017) Consequence of chitinase from Trichoderma viride integrated feed on digestive enzymes in Corcyra cephalonica (Stainton) and antimicrobial potential, Biosci. Biotech. Res. Asia, 14, 513-519, doi: 10.13005/bbra/2473.

5. Sakai, K., Uchiyama, T., Matahira, Y., and Nanjo, F. (1991) Immobilization of chitinolytic enzymes and continuous production of N-acetyl D-glucosamine with the immobilized enzymes, J. Ferment. Bioeng., 72, 168-172, doi: 10.1016/0922-338X(91)90211-X.

6. Saschiwa, H., Fujishima, S., and Yamano, N. (2002) Production of N-acetyl D-glucosamine from alpha-chitin by crude enzymes from Aeromonas hydrophila H-2330, Carbohydr. Res., 337, 761-763, doi: 10.1016/s0008-6215(02)00034-4.

7. Jain, T., Kumar, H., and Dutta, P. K. (2016) in Chitin and Chitosan for Regenerative Medicine (Dutta, P. K., ed.) Springer India, Bangalore, Mumbai, New Delhi, India, p. 279-295.

8. Wang, S.-L., Liang, T.-W., and Yen, Y.-H. (2011) Biocon-version of chitin-containing wastes for the production of enzymes and bioactive materials, Carbohydr. Pol., 84, 732-742, doi: 10.1016/j.carbpol.2010.06.022.

9. Thadathil, N., and Velappan, S. P. (2014) Recent developments in chitosanase research and its biotechnological applications: a review, Food Chem., 150, 392-399, doi: 10.1016/j.foodchem.2013.10.083.

10. Sakai, K., Yokota, A., Kurokawa, H., Wakayama, M., and Moriguchi, M. (1998) Purification and characterization of three thermostable endochitinases of a noble Bacillus strain, MH-1, isolated from chitin-containing compost, Appl. Environ. Microbiol., 64, 3397-3402, doi: 10.1128/AEM.64.9.3397-3402.1998.

11. Revah-Moiseev, S., and Carroad, P. A. (1981) Conversion of the enzymatic hydrolysate of shellfish waste chitin to single-cell protein, Biotechnol. Bioeng., 23, 1067-1078, doi: 10.1002/bit.260230514.

12. Dahia, N., Tiwari, R., Tiwari, R. P., and Hoondal, G. S. (2005) Production of an antifungal chitinase from Enterobacter sp. NRG4 and its application in protoplast production, World J. Microbiol. Biotechnol., 21, 1611-1615, doi: 10.1007/s11274-005-8343-6.

13. Johnson, E. A., Villa, T. G., Lewis, M. J., and Phaff, H. J. (1979) Lysis of the cell wall of yeast Phaffia rhodozyme by lytic complex from Bacillus circulans WL-12, J. Appl. Biochem., 1, 273-282.

14. Biotransformation of Waste Biomass into High Value Biochemicals (2014) (Brar, S. K., Dhillon, G. S., and Soccol, C., eds) Springer Verlag, N. Y., p. 504.

15. Камзолкина О. В., Дунаевский Я. Е. (2017) Биология грибной клетки. Учебное пособие. 2-е изд., Товарищество научных изданий КМК, Москва.

16. Kuranda, M. J., and Robbins, P. W. (1991) Chitinase is required for cell separation during growth of Saccharomyces cerevisiae, J. Biol. Chem., 266, 19707-19758.

17. Курченко В. П., Буга С. В., Петрашкевич Н. В., Буткевич Т. В., Ветошкин А. А., Демченков Е. Л., Лодыгин А. Д., Зуева О. Ю., Варламов В. П., Бородин О. И. (2016) Технологические основы получения хитина и хитозана из насекомых, Труды БГУ, 11, 110-126.

18. Середа А. С., Великорецкая И. А., Осипов Д. О., Матыс В. Ю., Бубнова Т. В., Немашкалов В. А., Синицына О. А., Рожкова А. М., Цурикова Н. В., Синицын А. П. (2018) Ферментные комплексы для разрушения клеточной стенки мицелиальных грибов – продуцентов промышленных ферментов, Известия Уфимского научного центра РАН, 3, 31-35.

19. Патент РФ 2361918.

20. Патент РФ 2378372.

21. Синицын А. П., Короткова О. Г., Рубцова Е. А., Синицына О. А., Кондратьева Е. Г., Середа А. С., Зоров И. Н., Рожкова А. М. (2019) Конструирование рекомбинантных продуцентов ферментных препаратов для кормопроизводства с помощью экспрессионной системы на основе гриба Penicillium verruculosum, Биотехнология, 35, 6-14, doi: 10.21519/0234-2758-2019-35-4-6-14.

22. Bukhtoyarov, F. E., Ustinov, B. B., Salanovich, T. N., Antonov, A. I., Gusakov, A. V., Okunev, O. N., and Sinitsyn, A. P. (2004) Cellulase complex of the fungus Chrysosporium lucknowense: isolation and characteristics of endoglucanases and cellobiohydrolases, Biochemistry (Moscow), 69, 542-551.

23. Merzlov, D. A., Zorov, I. N., Dotsenko, G. S., Denisenko, Y. A., Rozhkova, A. M., Satrutdinov, A. D., Rubtsova, E. A., Kondrat’eva, E. G., and Sinitsyn, A. P. (2015) Properties of Enzyme preparations and homogenous enzymes – endoglucanase EG2 Penicillium verruculosum and endoglucanase LAM Myceliophtora thermophila, Biochemistry (Moscow), 80, 473-482, doi: 10/1134/S0062979150401122

24. Semenova, M. V., Gusakov, A. V., Volkov, P. V., Matys, V. Yu., Nemashkalov, V. A., Telitsyn, V. D., Rozhkova, A. M., and Sinitsyn, A. P. (2019) Enhancement of the enzymatic cellulose saccharification by Penicillium verruculosum multienzyme cocktails containing homologously overexpressed lytic polysaccharide monooxygenase, Mol. Biol. Rep., 46, 2363-2370, doi: 10.1007/s11033-019-04693-y.

25. Aslanidis, C., and de Jong, J. P. (1990) Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR), Nucleic Acids Res., 18, 6069-6075, doi: 10.1093/nar/18.20.6069.

26. Nelson, N. A. (1944) Photometric adoption of the Somogyi method for the determination of glucose, J. Biol. Chem., 153, 375-379.

27. Somogyi, M. (1952) Notes on sugar determination, J. Biol. Chem., 195, 19-23.

28. Sinitsyna, O. A., Bukhtoyarov, F. E., Gusakov, A. V., Okunev, O. N., Bekarevich, A. O., Vinetsky, Y. P., and Sinitsyn, A. P. (2003) Isolation and properties of major components of Penicilium canescens extracellular enzyme complex, Biochemistry (Moscow), 68, 1200-1209.

29. Zorov, I. N., Dubasova, M. Y., Sinitsyn, A. P., Gusakov, A. V., Mytchenko, A. A., Baraznenok, V. A., Gutierrez, B., and Popova, N. N. (1997) Application of the bicinchininic method of assay for the reducing sugars to determine carboxymethylcellulase activity of cellulases using a microplate reader, Biochemistry (Moscow), 62, 704-709, doi: 10.1134/S0006297910010062.

30. Синицын А. П., Черноглазов В. М., Гусаков А. В. (1993) Методы изучения и свойства целлюлолитических ферментов. Серия «Биотехнология», 25 (Итоги науки и техники АН СССР), ВИНИТИ, Москва.

31. Decleire, M., De Cat, W., and Tang, V. H. (1996) in Chitin Enzymology (Muzzarelli, R. A. A., ed.) Atec Edizioni, Glottamare, Italy, 165-169.

32. Peterson, G. L. (1977) Review of the Folin phenol protein quantitation method of Lowry, Rosebrough, Farr and Randall, Anal. Biochem., 100, 201-220, doi: 10.1016/0003-2697(79)90222-7.

33. Aleksenko, A. Y., Makarova, N. A., Nikolaev, I. V., and Clutterbuck, A. J. (1995) Integrative and replicative transformation of Penicillium canescens with a heterologous nitrate-reductase gene, Curr. Genet., 28, 474-478, doi: 10.1007/BF00310818.

34. Чулкин А. М., Кислицин В. Ю., Зоров И. Н., Синицын А. П., Рожкова А. М. (2019) Определение копийности целевых генов карбогидраз в рекомбинантных штаммах гриба Penicillium verruculosum, Биотехнология, 35, 51-57, doi: 10.21519/0234-2758-2019-35-5-51-57.