БИОХИМИЯ, 2020, том 85, вып. 6, с. 831–839

УДК 577.151.32

Влияние замен остатка цистеина в составе мотива GCSAG активного центра на свойства эстеразы PMGL2

© 2020 М.В. Крюкова 1, Л.Е. Петровская 2*, К.А. Новотоцкая-Власова 3, Е.А. Крюкова 2, С.А. Якимов 2, А.Ю. Николаева 1, К.М. Бойко 4, Д.А. Долгих 2,5, М.П. Кирпичников 2,5

НИЦ «Курчатовский институт», 123182 Москва, Россия

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, Россия; электронная почта: lpetr65@yahoo.com

Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН, 142290 Пущино, Московская обл., Россия

Институт биохимии им. А.Н. Баха, ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук, 119071 Москва, Россия

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, биологический факультет, 119991 Москва, Россия

Поступила в редакцию 28.02.2020
После доработки 07.04.2020
Принята к публикации 09.04.2020

DOI: 10.31857/S0320972520060081

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: эстераза PMGL2, семейство HSL, мотив GCSAG, мутагенез, термостабильность, пространственная структура.

Аннотация

Эстераза PMGL2, ген которой был обнаружен в результате скрининга метагеномной библиотеки ДНК из вечномерзлого грунта, относится к семейству HSL (гормон-чувствительной липазы млекопитающих). Аминокислотная последовательность PMGL2 характеризуется наличием не описанного ранее варианта консервативного мотива активного центра GXSXG, включающего остаток Cys173 рядом с каталитическим остатком Ser174. С целью выяснения функциональной роли данного остатка цистеина сконструирован ряд мутантных вариантов PMGL2, содержащих в этом положении остатки треонина, аспарагиновой кислоты или серина, и определены их свойства. Удельная активность мутанта С173D по отношению к п-нитрофенилбутирату на 60% выше, чем для фермента дикого типа (wtPMGL2), в то время как вариант C173T/C202S продемонстрировал пониженную активность. По отношению к п-нитрофенилоктаноату, вариант С173D активнее wtPMGL2 на 15%, тогда как замены C173T/C202S понизили активность на 17%. Для мутанта С173D также характерна высокая активность в области пониженных температур (20–35 °C) при существенной потере термостабильности. Значение kcat для данного белка на 56% выше, чем для исходного фермента, тогда как для варианта С173S, который обнаружил наиболее высокую термостабильность среди исследованных мутантов, она такая же как для фермента дикого типа. Полученные результаты демонстрируют, что замены аминокислотных остатков, соседних с каталитическим остатком серина в составе мотива GXSXG, оказывают существенное влияние на свойства эстеразы PMGL2.

Сноски

* Адресат для корреспонденции.

Финансирование

Работу проводили при частичной финансовой поддержке гранта РФФИ № 18-04-00491 и Программы РАН «Молекулярная и клеточная биология».

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии между ними конфликта интересов.

Соблюдение этических норм

В статье отсутствуют исследования, в которых в качестве объектов использовали людей или животных.

Список литературы

1. Casas-Godoy, L., Duquesne, S., Bordes, F., Sandoval, G., and Marty, A. (2012) in Lipases and Phospholipases (Sandoval, G. ed.), Humana Press, pp. 3-30, doi: 10.1007/978-1-61779-600-5_1.

2. Gaur, R., Hemamalini, R., and Khare, S. (2017) in Current Developments in Biotechnology and Bioengineering (Pandey, A. N. S., and Soccol, C. R., eds) Elsevier, pp. 175-198, doi: 10.1016/B978-0-444-63662-1.00008-7.

3. Romano, D., Bonomi, F., Mattos, M. C., Fonseca, T. D., Oliveira, M. D. F., and Molinari, F. (2015) Esterases as stereoselective biocatalysts, Biotechnol. Adv., 33, 547-565, doi: 10.1016/j.biotechadv.2015.01.006.

4. Ollis, D. L., Cheah, E., Cygler, M., Dijkstra, B., Frolow, F., Franken, S. M., Harel, M., Remington, S. J., Silman, I., and Schrag, J. (1992) The α/β hydrolase fold, Protein Eng., 5, 197-211, doi: 10.1093/protein/5.3.197.

5. Nardini, M., and Dijkstra, B. W. (1999) α/β Hydrolase fold enzymes: the family keeps growing, Curr. Opin. Struct. Biol., 9, 732-737, doi: 10.1016/S0959-440X(99)00037-8.

6. Arpigny, J., and Jaeger, K. (1999) Bacterial lipolytic enzymes: classification and properties, Biochem. J., 343, 177-183, doi: 10.1042/bj3430177.

7. Ferrer, M., Bargiela, R., Martínez-Martínez, M., Mir, J., Koch, R., Golyshina, O. V., and Golyshin, P. N. (2015) Biodiversity for biocatalysis: a review of the α/β-hydrolase fold superfamily of esterases-lipases discovered in metagenomes, Biocat. Biotrans., 33, 235-249, doi: 10.3109/10242422.2016.1151416.

8. Kim, T. D. (2017) Bacterial hormone-sensitive lipases (bHSLs): Emerging enzymes for biotechnological applications, J. Microbiol. Biotechnol., 27, 1907-1915, doi: 10.4014/jmb.1708.08004.

9. Mirete, S., Morgante, V., and González-Pastor, J. E. (2016) Functional metagenomics of extreme environments, Curr. Opin. Biotech., 38, 143-149, doi: 10.1016/j.copbio.2016.01.017.

10. Handelsman, J. (2004) Metagenomics: application of genomics to uncultured microorganisms, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 68, 669-685, doi: 10.1128/MMBR.68.4.669-685.2004.

11. López-López, O., Cerdán, M. E., and Siso, M. I. G. (2014) New extremophilic lipases and esterases from metagenomics, Curr. Prot. Pept. Sci., 15, 445-455, doi: 10.2174/1389203715666140228153801.

12. Petrovskaya, L. E., Novototskaya-Vlasova, K. A.,Spirina, E. V., Durdenko, E. V., Lomakina, G. Y., Zavialova, M. G., Nikolaev, E. N., and Rivkina, E. M. (2016) Expression and characterization of a new esterase with GCSAG motif from a permafrost metagenomic library, FEMS Microbiol. Ecol., 92, fiw046, doi: 10.1093/femsec/fiw046.

13. Petrovskaya, L. E., Novototskaya-Vlasova, K. A., Gapizov, S. S., Spirina, E. V., Durdenko, E. V., and Rivkina, E. M. (2017) New member of the hormone-sensitive lipasefamily from the permafrost microbial community, Bioengineered, 8, 420-423, doi: 10.1080/21655979.2016.1230571.

14. Boyko, K. M., Kryukova, M. V., Petrovskaya, L. E., Nikolaeva, A. Y., Korzhenevsky, D. A., Novototskaya-Vlasova, K. A., Rivkina, E. M., Dolgikh, D. A., Kirpichnikov, M. P., and Popov, V. O. (2020) Crystal structure of PMGL2 esterase from the hormone-sensitive lipase family with GCSAG motif around the catalytic serine, PLoS One, 15, e0226838, doi: 10.1371/journal.pone.0226838.

15. Madeira, F., Park, Y. M., Lee, J., Buso, N., Gur, T., Madhusoodanan, N., Basutkar, P., Tivey, A. R. N.,Potter, S. C., Finn, R. D., and Lopez, R. (2019) The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019, Nucleic Acids Res., 47, W636-W641, doi: 10.1093/nar/gkz268.

16. Alcaide, M., Stogios, P. J., Lafraya, Б., Tchigvintsev, A., Flick, R., Bargiela, R., Chernikova, T. N., Reva, O. N., Hai, T., Leggewie, C. C., Katzke, N., La Cono, V., Matesanz, R., Jebbar, M., Jaeger, K.-E., Yakimov, M. M., Yakunin, A. F., Golyshin, P. N., Golyshina, O. V., Savchenko, A., Ferrer, M., and Consortium, T. M. (2015) Pressure adaptation is linked to thermal adaptation in salt-saturated marine habitats, Environ. Microbiol., 17, 332-345, doi: 10.1111/1462-2920.12660.

17. Li, P. Y., Ji, P., Li, C. Y., Zhang, Y., Wang, G. L.,Zhang, X. Y., Xie, B. B., Qin, Q. L., Chen, X. L., Zhou, B. C., and Zhang, Y. Z. (2014) Structural basis for dimerization and catalysis of a novel esterase from the GTSAG motif subfamily of the bacterial hormone-sensitive lipase family, J. Biol. Chem., 289, 19031-19041, doi: 10.1074/jbc.M114.574913.

18. Kourist, R., Brundiek, H., and Bornscheuer, U. T. (2010) Protein engineering and discovery of lipases, Europ. J. Lipid Sci. Technol., 112, 64-74, doi: 10.1002/ejlt.200900143.

19. Jochens, H., Hesseler, M., Stiba, K., Padhi, S. K., Kazlauskas, R. J., and Bornscheuer, U. T. (2011) Protein engineering of alpha/beta-hydrolase fold enzymes, Chembiochem, 12, 1508-1517, doi: 10.1002/cbic.201000771.

20. Kulakova, L., Galkin, A., Nakayama, T., Nishino, T., and Esaki, N. (2004) Cold-active esterase from Psychrobacter sp. Ant300: gene cloning, characterization, and the effects of Gly→Pro substitution near the active site on its catalytic activity and stability, Biochim. Biophys. Acta, 1696, 59-65, doi: 10.1016/j.bbapap.2003.09.008.

21. Kobayashi, R., Hirano, N., Kanaya, S., Saito, I., and Haruki, M. (2010) Enhancement of the enzymatic activity of Escherichia coli acetyl esterase by random mutagenesis, J. Mol. Cat. B: Enzymatic, 67, 155-161, doi: 10.1016/j.molcatb.2010.08.003.

22. Manco, G., Mandrich, L., and Rossi, M. (2001) Residues at the active site of the esterase 2 from Alicyclobacillus acidocaldarius involved in substrate specificity and catalytic activity at high temperature, J. Biol. Chem., 276, 37482-37490, doi: 10.1074/jbc.M103017200.

23. Sayer, C., Isupov, M. N., Bonch-Osmolovskaya, E., and Littlechild, J. A. (2015) Structural studies of a thermophilic esterase from a new Planctomycetes species, Thermogutta terrifontis, FEBS J., 282, 2846-2857, doi: 10.1111/febs.13326.

24. Kim, B. Y., Yoo, W., Huong Luu Le, L. T., Kim, K. K., Kim, H. W., Lee, J. H., Kim, Y. O., and Kim, T. D. (2019) Characterization and mutation anaylsis of a cold-active bacterial hormone-sensitive lipase from Salinisphaera sp. P7-4, Arch. Biochem. Biophys., 663, 132-142, doi: 10.1016/j.abb.2019.01.010.

25. Lan, D., Xu, H., Xu, J., Dubin, G., Liu, J., Khan, F. I., and Wang, Y. (2017) Malassezia globosa MgMDL2 lipase: Crystal structure and rational modification of substrate specificity, Biochem. Biophys. Res. Commun., 488, 259-265, doi: 10.1016/j.bbrc.2017.04.103.

26. Jeon, J. H., Lee, H. S., Kim, J. T., Kim, S. J., Choi, S. H., Kang, S. G., and Lee, J. H. (2012) Identification of a new subfamily of salt-tolerant esterases from a metagenomic library of tidal flat sediment, Appl. Microbiol. Biotechnol., 93, 623-631, doi: 10.1007/s00253-011-3433-x.

27. Novototskaya-Vlasova, K., Petrovskaya, L., Yakimov, S., and Gilichinsky, D. (2012) Cloning, purification, and characterization of a cold adapted esterase produced by Psychrobacter cryohalolentis K5T from Siberian cryopeg, FEMS Microbiol. Ecol., 82, 367-375, doi: 10.1111/j.1574-6941.2012.01385.x.

28. Novototskaya-Vlasova, K., Petrovskaya, L., Kryukova, E., Rivkina, E., Dolgikh, D., and Kirpichnikov, M. (2013) Expression and chaperone-assisted refolding of a new cold-active lipase from Psychrobacter cryohalolentis K5T, Protein Expr. Purif., 91, 96-103, doi: 10.1016/j.pep.2013.07.011.

29. Novototskaya-Vlasova, K., Petrovskaya, L., Rivkina, E., Dolgikh, D., and Kirpichnikov, M. (2013) Characterization of a cold-active lipase from Psychrobacter cryohalolentis K5T and its deletion mutants, Biochemistry (Moscow), 78, 385-394, doi: 10.1134/S000629791304007X.

30. Siddiqui, K. S., and Cavicchioli, R. (2006) Cold-adapted enzymes, Annu. Rev. Biochem., 75, 403-433, doi: 10.1146/annurev.biochem.75.103004.142723.

31. Feller, G., and Gerday, C. (2003) Psychrophilic enzymes: hot topics in cold adaptation, Nat. Rev. Microbiol., 1, 200-208, doi: 10.1038/nrmicro773.

32. Emsley, P., and Cowtan, K. (2004) Coot: Model-building tools for molecular graphics, Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 60, 2126-2132, doi: 10.1107/S0907444904019158.