БИОХИМИЯ, 2020, том 85, вып. 6, с. 807–816

УДК 548.73

Высокоактивная рекомбинантная формиатдегидрогеназа патогенных бактерий Staphylococcus aureus: получение и кристаллизация*

© 2020 А.А. Пометун 1,2,3#, К.М. Бойко 2#, Т.С. Юрченко 1,3, А.Ю. Николаева 2,4, И.С. Каргов 2,3, Д.Л. Атрошенко 1,2,3, С.С. Савин 1,2,3, В.О. Попов 2,4, В.И. Тишков 1,2,3**

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультет, 119991 Москва, Россия; электронная почта: vitishkov@gmail.com

Институт биохимии им. А.Н. Баха, ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук, 119071 Москва, Россия

ООО «Инновации и высокие технологии МГУ», 109559 Москва, Россия

НИЦ «Курчатовский институт», 123182 Москва, Россия

Поступила в редакцию 16.04.2020
После доработки 02.05.2020
Принята к публикации 02.05.2020

DOI: 10.31857/S0320972520060068

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: формиатдегидрогеназа, Staphylococcus aureus, экспрессия, очистка, кристаллизация, рентгеноструктурный анализ.

Аннотация

NAD+-зависимая формиатдегидрогеназа бактерий Staphylococcus aureus (SauFDH) является одним из ключевых ферментов, отвечающих за выживание этого патогена в условиях биопленок. Высокоселективные ингибиторы SauFDH могут быть использованы в качестве антибактериального препарата именно против биопленок S. aureus. Наиболее перспективным путем является поиск таких ингибиторов на основе трехмерной структуры фермента. Проведено культивирование штамма E. coli – суперпродуцента рекомбинантной SauFDH с выходом 1 г целевого белка с литра среды. Разработана и оптимизирована процедура выделения и очистки, позволившая получить 400 мг гомогенного фермента с выходом 61%. Показано, что SauFDH имеет самую высокую удельную активность 20 ед. на мг белка, что в два раза выше по сравнению с таковой для всех описанных формиатдегидрогеназ. Проведено два цикла поиска и оптимизации условий кристаллизации. В результате для апо- и холо-форм SauFDH получены кристаллы размером 200 и 40 мкм соответственно. Проведен сбор наборов дифракционных данных, определены пространственные группы и параметры элементарных ячеек. Кристаллы апо- и холо-форм SauFDH, которые дифрагировали до разрешения 2,2 и 2,7 Å соответственно, принадлежали к разным пространственным группам, что может свидетельствовать о связывании кофактора в случае холо-формы фермента.

Сноски

* Первоначально английский вариант рукописи опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow) http://protein.bio.msu.ru/biokhimiya, в рубрике «Papers in Press», BM20-094, 29.05.2020.

** Адресат для корреспонденции.

# Авторы внесли равный вклад в работу.

Финансирование

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке РФФИ (соглашения 17-04-01662 и 20-04-00915 – получение и кристаллизации фермента), Федерального космического агентства (эксперимент «Кристаллизатор» – кристаллизация и сбор данных рентгеноструктурного эксперимента) и Министерства науки и высшего образования РФ (предварительный анализ данных РСА).

Благодарности

При проведении исследований было использовано оборудование Центра коллективного пользования «Промышленные биотехнологии» ФГУ ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН».

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм

Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

Список литературы

1. Tishkov, V. I., and Popov, V. O. (2004) Catalytic mechanism and application of formate dehydrogenase, Biochemistry (Moscow), 69, 1252-1267, doi: 10.1007/s10541-005-0071-x.

2. Tishkov, V. I., and Popov, V. O. (2006) Protein engineering of formate dehydrogenase, Biomol. Eng., 23, 89-110, doi: 10.1016/j.bioeng.2006.02.003.

3. Alekseeva, A. A., Savin, S. S., and Tishkov, V. I. (2011) NAD+-dependent formate dehydrogenase from plants, Acta Naturae, 3, 38-54, PMID 22649703.

4. Resch, A., Rosenstein, R., Nerz, C., and Gotz, F. (2005) Differential gene expression profiling of Staphylococcus aureus cultivated under biofilm and planktonic conditions, Appl. Environ. Microbiol., 71, 2663-2676.

5. Tishkov, V. I., Pometun, A. A., Stepashkina, A. V., Fedorchuk, V. V., Zarubina, S. A., Kargov, I. S., Atroshenko, D. L., Parshin, P. D., Kovalevski, R. P., Boiko, K. M., Eldarov, M. A., D’Oronzo, E., Facheris, S., Secundo, F., and Savin, S. S. (2018) Rational design of practically important enzymes, Moscow Univ. Chem. Bull., 73, 1-6, doi: 10.3103/S0027131418020153.

6. Pace, C. N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G., and Gray, T. (1995) How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein, Protein Sci., 4, 2411-2423, doi: 10.1002/pro.5560041120.

7. Boyko, K. M., Lipkin, A. V., Popov, V. O., and Kovalchuk, M. V. (2013) From gene to structure: the protein factory of the NBICS centre of Kurchatov institute, Crystallogr. Rep., 58, 442-449, doi: 10.1134/S106377451105004x.

8. De Sanctis, D., Beteva, A., Caserotto, H., Dobias, F., Gabadinho, J., Giraud, T., Gobbo, A., Guijarro, M., Lentini, M., Lavault, B., Mairs, T., McSweeney, S., Petitdemange, S., Rey-Bakaikoa, V., Surr, J., Theveneau, P., Leonard, G. A., and Mueller-Dieckmann, C. (2012) ID29: a high-intensity highly automated ESRF beamline for macromolecular crystallography experiments exploiting anomalous scattering, J. Synchrotron Radiat., 19, 455-461, doi: 10.1107/S0909049512009715.

9. Otwinowski, Z., and Minor, W. (1997) Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode, Methods Enzymol., 276, 307-326.

10. Bourenkov, G. P., and Popov, A. N. (2006) A quantitative approach to data-collection strategies, Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 62, 58-64, doi: 10.1107/S0907444905033998.

11. Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., and Leslie, A. G. W. (2011) iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM, Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 67, 271-281, doi: 10.1107/S0907444910048675.

12. Kabsch, W. (2010) XDS, Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 66, 125-132, doi: 10.1107/S0907444909047337.

13. Yu, S., Zhu, L., Zhou, C., An, T., Zhang, T., Jiang, B., and Mu, W. (2014) Promising properties of a formate dehydrogenase from a methanol-assimilating yeast Ogataea parapolymorpha DL-1 in His-tagged form, Appl. Microbiol. Biotechnol., 98, 1621-1630, doi: 10.1007/s00253-013-4996-5.

14. Ordu, E. B., and Karagüler, N. G. (2007) Improving the purification of NAD+-dependent formate dehydrogenase from Candida methylica, Prepar. Biochem. Biotechnol., 37, 333-341, doi: 10.1080/10826060701593233.

15. Esen, H., Alpdağtaş, S., Mervan Çakar, M., and Binay, B. (2019) Tailoring of recombinant FDH: effect of histidine tag location on solubility and catalytic properties of Chaetomium thermophilum formate dehydrogenase (CtFDH), Prepar. Biochem. Biotechnol., 49, 529-534, doi: 10.1080/10826068.2019.1599394.

16. Пометун А. А., Паршин П. Д., Галаничева Н. П., Упоров И. В., Атрошенко Д. Л., Савин С. С., Тишков В. И. (2020) Влияние последовательности His6 на свойства формиатдегидрогеназы из бактерий Pseudomonas sp. 101, Вестник МГУ, Cер. 2 Химия, 61, 317-325.

17. Rojkova, A. M., Galkin, A. G., Kulakova, L. B., Serov, A. E., Savitsky, P. A., Fedorchuk, V. V., and Tishkov, V. I. (1999) Bacterial formate dehydrogenase. Increasing the enzyme thermal stability by hydrophobization of alpha helices, FEBS Lett., 445, 183-188, doi: 10.1016/S0014-5793(99)00127-1.

18. Pometun, A. A., Kleymenov, S. Yu, Zarubina, S. A., Kargov, I. S., Parshin, P. D., Sadykhov, E. G., Savin, S. S., and Tishkov, V. I. (2018) Comparison of thermal stability of new formate dehydrogenases with differential scanning calorimetry, Moscow Univ. Chem. Bull., 73, 80-84, doi: 10.3103/S002713141802013X.

19. Slusarczyk, H., Felber, S., Kula, M. R., and Pohl, M. (2000) Stabilization of NAD-dependent formate dehydrogenase from Candida boidinii by site-directed mutagenesis of cysteine residues, Eur. J. Biochem., 267, 1280-1289, doi: 10.1046/j.1432-1327.2000.01123.x.

20. Tishkov, V. I., Goncharenko, K. V., Alekseeva, A. A., Kleymenov, S. Yu., and Savin, S. S. (2015) Role of a structurally equivalent phenylalanine residue in catalysis and thermal stability of formate dehydrogenases from different sourсes, Biochemistry (Moscow), 80, 1690-1700, doi: 10.1134/S0006297915130052.

21. Alekseeva, A. A., Fedorchuk, V. V., Zarubina, S. A., Sadykhov, E. G., Matorin, A. D., Savin, S. S., andTishkov, V. I. (2015) Role of Ala198 in stability and coenzyme specificity of bacterial formate dehydrogenases, Acta Naturae, 7, 60-69, PMID: 25927002.

22. Slusarczyk, H., Felber, S., Kula, M.-R., and Pohl, M. (2003) Novel mutants of formate dehydrogenase from Candida boidinii, US Patent Application Publication US2003/0157664, 21.09.2003.

23. Kargov, I. S., Kleymenov, S. Y., Savin, S. S., Tishkov, V. I., and Alekseeva, A. A. (2015) Improvement of the soy formate dehydrogenase properties by rational design, Prot. Eng. Des. Select., 28, 171-178, doi: 10.1093/protein/gzv007.

24. Matthews, B. W. (1968) Solvent content of protein crys-tals, J. Mol. Biol., 33, 491-497, doi 10.1016/0022-2836(68)90205-2.

25. Winn, M. D., Ballard, C. C., Cowtan, K. D., Dodson, E. J., Emsley, P., Evans, P. R., Keegan, R. M., Krissinel, E. B., Leslie, A. G., McCoy, A., McNicholas, S. J., Murshudov, G. N., Pannu, N. S., Potterton, E. A., Powell, H. R.,Read, R. J., Vagin, A., and Wilson, K. S. (2011) Overview of the CCP4 suite and current developments, Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 67, 235-242, doi: 10.1107/S0907444910045749.