Экспрессия синтетического гена интерферона-α8 человека под контролем промотора P_BAD^*

Аннотация

Рекомбинантный интерферон-α8 человека (rhIFN-α8) был получен путем экспрессии в E. coli синтетического гена с оптимизированными кодонами, сконструированного с использованием двухступенчатой полимеразной цепной реакции (ПЦР). Ген, кодирующий человеческий интерферон-α8 (hIFN-α8), содержит большое количество «редких» кодонов. Они были заменены на кодоны, наиболее используемые в клетках E. coli, а также было сбалансировано соотношение нуклеотидных пар TA-GC во всем гене интерферона. Двухступенчатая ПЦР была выполнена с помощью длинных (45–60 нуклеотидов) частично перекрывающихся праймеров и двух ДНК полимераз (pfu и GC-RICH системы). В результате амплификации был получен ген, размером 504 пар нуклеотидов (п.н.), что соответствовало размерам последовательности, кодирующей IFN-α8; причем сама полимераза pfu была не способна амплифицировать ген нужного размера, а в составе продуктов ПЦР присутствовали аберрантные фрагменты. Полноразмерный ген был клонирован в экспрессионный вектор pBAD-TOPO, затем ориентация гена в конструкции была изменена путем обработки рестриктазой NcoI с последующим лигированием. Полученная в результате плазмида pBAD-TOPO-IFN-α8 (pBAD-IFNα8) содержала ген IFN-α8 под транскрипционным контролем промотора P_BAD, индуцируемого арабинозой. Для получения максимального выхода растворимого интерферона-α8, были подобраны оптимальные условия его экспрессии: концентрация L-арабинозы, температура и время индукции экспрессии. Экспрессированный IFN-α8 был охарактеризован в Ds-Na-ПААГ-электрофорезе и иммунохимическими методами. После хроматографической очистки рекомбинантного IFN-α8 на ДЭАЭ-сефарозе его выход составил 100 мг на 1 л клеточной культуры. Дана сравнительная оценка антивирусной и противораковой активности IFN-α8 и IFN-α2a человека.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: