Стабилизация рекомбинантной формиатдегидрогеназы из сои Glycine max методом рационального дизайна

Аннотация

Рекомбинантная формиатдегидрогеназа из сои (SoyFDH) имеет самые низкие значения констант Михаэлиса как по субстрату, так и коферменту, но уступает по термостабильности формиатдегидрогеназам из других источников. Для получения мутантных SoyFDH, обладающих улучшенной термостабильностью, были проведены анализ пространственной структуры фермента и сравнение аминокислотных последовательностей ФДГ из различных источников. Методом направленного мутагенеза получено десять мутантных ферментов, которые были очищены и охарактеризованы. Термостабильность полученных мутантов исследовали двумя способами – по кинетике термоинактивации и с помощью метода дифференциальной сканирующей калориметрии. В случае мутантных SoyFDH с заменами A267M и A267M/I272V (М1 и М2 соотвественно) происходило увеличение термостабильности. Эффект стабилизации зависел от температуры и при 52° для мутеинов М1 и М2 составил 3,6 и 11 раз соответственно. Данные дифференциальной сканирующей калориметрии подтверждают, что для мутантных SoyFDH Ala267Met и Ala267Met/Ile272Val произошло увеличение термостабильности по сравнению с исходной SoyFDH – положение максимума на кривой плавления (T_m) возросло на 2,7 и 4,6° соответственно. В случае замен L24D и V127R произошло снижение стабильности: константы скорости термоинактивации при 52° возросли в 5 и 2,5 раза, а значения T_m уменьшились на 3,5 и 1,7 градуса соответственно. Для остальных мутантных SoyFDH с заменами G18A, K23T, K109P, N247E, V281I и S354P термостабильность практически не изменилась. Данные по определению кинетических свойств показали, что в случае замен V127R и A267M происходит увеличение каталитической константы с 2,9 до 3,6 и 5,0 с^–1 соответственно, и снижение (улучшение) константы Михаэлиса по NAD⁺ с 13,3 до 9,5 и 9,9 мкМ соответственно.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: