Процессивный характер действия пшеничных эндонуклеаз WEN1 и WEN2. Кинетические параметры

Аннотация

Mg²⁺-, Са²⁺-, S-аденозил-L-метионин (SAM)-зависимые, чувствительные к статусу метилирования субстратных ДНК эндонуклеазы WEN1 и WEN2 из проростков пшеницы обладают выраженным процессивным действием. Гидролиз ими ДНК происходит в несколько последовательных этапов: сначала ферменты сайт-специфично гидролизуют ДНК λ-фага (по CNG-сайтам, фермент WEN1) с высвобождением крупных фрагментов, потом эти фрагменты гидролизуются до олигонуклеотидов длиной 120–140 пар нуклеотидов, которые при последующем гидролизе расщепляются до более коротких фрагментов и мононуклеотидов. Начальные этапы гидролиза ДНК могут происходить в отсутствие Mg²⁺, а последующий гидролиз ДНК стимулируется Mg²⁺. Не исключено, что модуляция действия ферментов ионами Mg²⁺ и, по-видимому, образовавшимися фрагментами ДНК сопровождается реорганизацией структуры эукариотических (пшеничных) эндонуклеаз с изменением их каталитических свойств и сайтовой специфичности действия. Константа Михаэлиса при гидролизе ферментом WEN1 метилированной ДНК в 4 раза ниже, чем при гидролизе неметилированной. Это может указывать на то, что сродство фермента к метилированной ДНК, содержащей сайты Cm⁵CWGG и Gm⁶AT, гораздо выше, чем к неметилированной. В присутствии SAM константы Михаэлиса для WEN2 на стадии гидролиза с образованием фрагментов ДНК длиной 120–140 пар нуклеотидов меньше, чем без SAM, а для WEN1 они больше в 1,5–2 раза. Этим подтверждено, что SAM ингибирует WEN1 и стимулирует WEN2. Таким образом, пшеничные эндонуклеазы WEN1 и WEN2 существенно различаются по сродству к субстратным ДНК с разными статусами метилирования, по скоростям гидролиза ДНК и по временам образования сходных по длине фрагментов ДНК. По-видимому, изученные эндонуклеазы могут гидролизовать ДНК и в клеточном ядре не только до крупных, но и до очень небольших фрагментов, в том числе мононуклеотидов, участвуя, например, в утилизации ядерного материала клетки при апоптозе.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: