БИОХИМИЯ, 2011, том 76, вып. 11, с. 1532–1541
УДК 577.152.1
Участие консервативных остатков Glu255 и Cys289 в каталитической активности рекомбинантной альдегиддегидрогеназы у Bacillus licheniformis
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: альдегиддегидрогеназа, Bacillus licheniformis, сайтнаправленный мутагенез, дегидрогеназаная активность, флуоресценция, круговой дихроизм.
Аннотация
На основе гомологии последовательности смоделирована трехмерная структура альдегиддегидрогеназы из Bacillus licheniformis (BlALDH) и выявлены два остатка (Glu255 и Cys289), которые предположительно ответственны за каталитическую функцию фермента. В дальнейшем роль данных остатков была изучена с помощью сайтнаправленного мутагенеза и биофизического анализа. Экспрессированные исходные и мутантные белки были очищены методом никель-хелатной хроматографии, и их молекулярные массы были определены в районе 53 кДа электрофорезом в Ds-Na-ПААГ. По сравнению с содержанием исходной BlALDH для мутантного фермента наблюдали резкое уменьшение или даже полную потерю активности ALDH. Структурный анализ показал, что собственная флуоресценция и круговой дихроизм спектров мутантных белков аналогичны таковым для исходных белков, но большинство вариантов проявляли различную чувствительность к денатурации, вызванной изменением температуры или гидрохлоридом гуанидина. Эти наблюдения свидетельствут о том, что остатки Glu255 и Cys289 играют важную роль в дегидрогеназной активности BlALDH, а устойчивость фермента изменилась вследствие мутаций.