БИОХИМИЯ, 2011, том 76, вып. 1, с. 188–200
УДК 547.963.057:577.24
Фотоактивируемые ДНК-аналоги субстратов системы эксцизионной репарации нуклеотидов и их взаимодействие с белками NER-компетентного экстракта клеток HeLa. Синтез и применение протяженных модельных ДНК
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: протяженные ДНК-дуплексы с объемными заместителями, белковые факторы предынцизионных комплексов NER, фотоаффинная модификация.
Аннотация
Синтезированы протяженные (размером 137 пар оснований (п.о.)) линейные ДНК-аналоги субстратов NER, представляющие собой дуплексы, содержащие во внутренних позициях нуклеотиды с объемными заместителями, имитирующими повреждение фторхлоразидопиридильной и флуоресцеиновой группировками, введенными с помощью спейсерных фрагментов по 4N– и 5C-положениям dC и dU (Fap-dC- и Flu-dU-ДНК), и ДНК, содержащая (+)-цис-стереоизомер бензо[a]пирен-N2-дезоксигуанидина (BP-dG-ДНК, 131 п.о.). Исследовано взаимодействие модифицированных ДНК-дуплексов с белками в экстрактах клеток HeLa, содержащих основные компоненты белковых комплексов NER (NER-компетентного экстракта). Показано, что субстратные свойства модельных ДНК в реакции специфической эксцизии меняются в ряду Fap-dC-ДНК<<Flu-dU-ДНК<BP-dG-ДНК. При проведении экспериментов по аффинной модификации белков NER-компетентного экстракта Fаp-dC-ДНК (137 п.о.), содержащая [32Р]-метку в фотоактивном нуклеотиде, продемонстрировала свойства весьма эффективного и селективного зонда. Набор основных мишеней мечения включал в себя полипептиды экстракта с теми же значениями кажущихся молекулярных масс (35–90 кДа), что и при использовании более коротких (48 п.о.) Fap-dC-ДНК. Выявлены также белки с экстракта, способные специфически и эффективно взаимодействовать с протяженным аналогом субстрата NER. Электрофоретическая подвижность этих белков совпадала с подвижностями ДНК-связывающей субъединицы XPC-HR23B и PARP1 (~127 и ~115 кДа соответственно). С применением функционального теста, основанного на использовании NAD+, 115-кДа белок-мишень идентифицирован как PARP1. Полученные результаты позволяют рассматривать линейную Fap-dC-ДНК как нерепарируемый аналог субстрата, способный конкурировать с эффективными субстратами NER в связывании белков, ответственных за узнавание и эксцизию повреждения.