БИОХИМИЯ, 2010, том 75, вып. 12, с. 1651–1661
УДК 577.152.411+577.175.122
Клонирование и характеристика индолил-3-пируватдекарбоксилазы из Methylobacterium extorquens AM1
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: Methylobacterium extorquens, индолил-3-пируватдекарбоксилаза, гетерологичная экспрессия, кинетические свойства, мутанты.
Аннотация
Впервые у метилотрофных бактерий обнаружен фермент биосинтеза фитогормона индолил-3-уксусной кислоты – индолил-3-пируватдекарбоксилаза (КФ 4.1.1.74). C помощью программы BLAST в геноме факультативного метилотрофа Methylobacterium extorquens AM1 выявлена открытая рамка считывания гена, кодирующего тиаминпирофосфат-зависимую декарбоксилазу α-кетокислот и проявляющую сходство с индолилпируватдекарбоксилазами – ключевыми ферментами биосинтеза индолил-3-уксусной кислоты. Открытая рамка считывания гена, названного нами ipdC, клонирована в экспрессионном векторе pET-22b(+). Рекомбинантный белок IpdC был очищен из Escherichia coli BL21(DE3) и охарактеризован. Фермент декарбоксилировал бензоилформиат с наибольшей скоростью (kcat), хотя в реакции с индолилпируватом проявлял наибольшую константу специфичности (kcat/Km). Молекулярная масса холофермента, определенная методом гель-фильтрации, составила 245 кДа, что соответствует гомотетрамерной структуре. Нокаут-мутант M. extorquens по гену ipdC, выращенный в присутствии триптофана, синтезировал на 54% меньше индолил-3-уксусной кислоты, чем штамм дикого типа. Комплементация мутации привела к увеличению в 6,3 раза содержания индолил-3-уксусной кислоты в культуральной жидкости по сравнению с мутантом. Таким образом, доказано участие IpdC в биосинтезе индолил-3-уксусной кислоты у M. extorquens.