БИОХИМИЯ, 2010, том 75, вып. 11, с. 1533–1543
УДК 577.152.191.3
Определение каталазной активности цитохром с-оксидазы с помощью электродного микросенсора на перекись водорода
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: микросенсор, берлинская лазурь, дыхательная цепь, цитохром с-оксидаза, кислородные интермедиаты, каталазная активность.
Аннотация
Микроэлектрод-сенсор с покрытием из гексацианата железа (берлинской лазури) был использован для измерения в непрерывном режиме кинетики распада перекиси водорода, катализируемой окисленной цитохромоксидазой. При концентрации цитохромоксидазы ~1 мкМ каталазная активность фермента соответствует реакции первого порядка по перекиси вплоть до концентраций 300–400 мкМ и полностью блокируется после тепловой инактивации цитохромоксидазы. При pH 7 и комнатной температуре каталазная (или, скорее, «псевдокаталазная») активность бычьей цитохромоксидазы характеризуется константой скорости второго порядка 2 · 102 М–1 · с–1, которая, с учетом того что ее нужно разделить на число молекул перекиси (2 или 3), исчезающих за один оборот цикла, находится в разумном соответствии с константой скорости второго порядка для H2O2-зависимого превращения кислородных интермедиатов FI-607 →FII-580 в ходе катализа. Таким образом, каталазную активность бычьей цитохромоксидазы можно объяснить превращениями перекиси водорода в кислородредуктазном центре фермента, в результате которых образуются радикалы супероксида. Существенно бóльшие удельные скорости распада H2O2 наблюдаются на препаратах бактериальной цитохромоксидазы из Rhodobacter sphaeroides. Кажущаяся константа скорости второго порядка (до ~3000 М–1 · с–1) в несколько раз превышает скорость связывания перекиси с окисленной оксидазой (~500 М–1 · с–1) и, следовательно, не может объясняться каталитическими реакциями в a3/CuB-сайте фермента. Ускоренный распад перекиси в случае бактериальной цитохромоксидазы может быть вызван ее взаимодействием с присутствующими в среде примесями ионов переходных металлов, которые прочно удерживаются на имеющейся у фермента «полигисидиновой ручке», либо в результате реакции с ионами прочно связанного Mn2+, который в бактериальных оксидазах часто заменяет Mg2+, имеющийся у митохондриальной цитохромоксидазы.