БИОХИМИЯ, 2010, том 75, вып. 8, с. 1157–1165
УДК 537.364:543.545
Доказательство димер-олигомерного состояния родопсина лягушки: визуализация олигомеров на геле после BN- и HRCN-ПААГ-электрофорезов с помощью антител к родопсину и по флуоресценции ретинилопсина
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: родопсин лягушки, олигомеризация, BN-ПААГ-электрофорез, HRCN-ПААГ-электрофорез, антитела, флуоресценция, ретинилопсин, дигитонин, додецилмальтозид, Ds-Na.
Аннотация
Окраска антителами и флуоресценция ретинилопсина показали, что солюбилизированный DIG, DM и Ds-Na родопсин лягушки после BN-ПААГ- и HRCN-ПААГ-электрофорезов находится в градиентном геле в состоянии димера с незначительным содержанием высших олигомеров (тример, квадромер и т.д.). По мере увеличения жесткости детергентов (DIG<DM<Ds-Na) доля высших олигомеров в экстрактах становится более заметной. Образование ретинилопсина в суспензии наружных сегментов палочек благодаря действию 0,7 M NaBH3CN при рН 5,0 происходит только в том случае, если одновременно с восстановлением родопсин подвергается фотолизу. ДТТ в концентрации 0,005 M в роли восстановителя оказался неэффективным. Образование стабильной связи C–N между полностью-транс-ретиналем и опсином в ретинилопсине сопровождается на электрофореграммах уменьшением и увеличением долей димера и высших олигомеров соответственно за счет процессов вторичной диссоциации-агрегации солюбилизированного опсина. Местоположение димера родопсина по отношению к аноду при нативном электрофорезе зависит не только от его массы, но и от степени развернутости (или формы): чем жестче детергент, тем ближе к аноду располагается димер. Обработка наружных сегментов палочек агентами, модифицирующими холестерин мембраны (MβCD, филипин III, нистатин, сапонин) не изменяла выявленный характер олигомеризации родопсина. Это свидетельствует, что целостность холестеринового компонента липидов фоторецепторной мембраны не является определяющим фактором в олигомеризации опсина. Делается вывод, что димер-олигомерный «портрет» родопсина лягушки, обнаруженный нами двумя методами нативного электрофореза в трех детергентах разной степени жесткости, соответствует физиологическому состоянию этого белка в нативной фоторецепторной мембране.