БИОХИМИЯ, 2010, том 75, вып. 8, с. 1079–1090
УДК 577.112.855
Анализ подвижности и функционального состояния белка ядрышка фибрилларина в живых клетках HeLa
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: фибрилларин, Cys99, Cys268, сайт-специфический мутагенез, FRAP, подвижность белка, клетки HeLa.
Аннотация
Белок фибрилларин – это эволюционно-консервативный и обязательный компонент ядрышек клеток эукариот, участвующий в процессинге и метилировании пре-рРНК. В молекуле фибрилларина позвоночных содержатся два остатка цистеина (Cys99 и Cys268), сульфгидрильные группы которых могут образовывать внутримолекулярные –S-S-мостики. Однако функциональное состояние фибрилларина с восстановленными и окисленными тиоловыми группами практически не изучено. Кроме того, в литературе отсутствуют данные о существовании –S-S-формы фибрилларина в клетках человека. Для решения этих вопросов в своем исследовании мы использовали плазмиды, кодирующие нативный фибрилларин человека и его мутантную форму, лишенную остатков цистеинов (фибрилларинС99/268S), слитые с EGFP для временной трансфекции клеток HeLa. Долю мобильной фракции, указывающую на содержание энзиматически активных молекул белка, и время полувосстановления флуоресценции, характеризующее скорость энзиматических реакций, определяли методом FRAP с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа. Измерения проводили при температурах 37° и 27°. Полученные результаты показали, что пул фибрилларина в клетках HeLa включает две формы: с восстановленными SH-группами и окисленными SH-группами, образующими внутримолекулярные –S-S-мостики между Cys99 и Cys268. Однако отсутствие Cys99 и Cys268 не влияет на локализацию фибрилларина в клетках и его основные динамические свойства. Форма фибрилларина человека без дисульфидных мостиков входит в состав мобильной фракции белка и соответствует его функционально активному состоянию.