БИОХИМИЯ, 2010, том 75, вып. 2, с. 297–304
УДК 577.152.1
Выделение и свойства алкогольоксидазы из Pichia putida
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: алкогольоксидаза, субъединицы, четвертичная структура, кристаллизация.
Аннотация
Алкогольоксидазу (АО) выделяли из дрожжей Pichia putida и очищали разными способами. По данным аналитического центрифугирования, гельфильтрации на сефарозе 2В и Ds-Na-ПААГ-электрофореза выделенная АО была гомогенна. Молекулярная масса фермента составляла около 600 кДа. При Ds-Na-ПААГ-электрофорезе наблюдали одну полосу белка с молекулярной массой 74 ± 4 кДа, а в ПААГ-электрофорезе нативного фермента – 8–9 полос с близкими удельной активностью и субстратной специфичностью. Обнаружено, что алкогольоксидаза состоит из восьми субъединиц с идентичными молекулярными массами. Каждая субъединица содержит одну молекулу FAD и около двух остатков Cys. По данным электронной микроскопии субъединицы расположены в вершинах двух квадратов с точечной симметрией 422D4. Выявлено, что активность фермента с оптимумом при рН 8,5–9 варьирует от 10 до 50 мкмоль метанола в 1 мин на 1 мг белка в зависимости от партии клеток и метода очистки и линейно зависит от концентрации белка. Фермент инактивируется при 20°, но остается стабильным в фосфатно-цитратном буфере в присутствии 30–50% (m/V) сахарозы. Получен фермент в кристаллической форме, однако эти кристаллы не давали рентгеновских рефлексов, по-видимому, в результате его молекулярной микрогетерогенности.