БИОХИМИЯ, 2010, том 75, вып. 1, с. 136–141

УДК 577.152.2

Идентификация функциональных остатков в глутатион-S-трансферазе Z-класса Arabidopsis thaliana методом скрининга неактивных точечных мутантов

© 2010 С. Чэнь, Ц. Лю, П. Ян, Д. Чэнь

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: функциональные остатки, случайная мутация, сайтнаправленный мутагенез, Arabidopsis thaliana, глутатион-S-трансфераза Z-класса.

Аннотация

Функциональные остатки глутатион-S-трансферазы Z-класса идентифицированы путем скрининга неактивных точечных мутантов из библиотеки, полученной методом случайного мутагенеза. С использованием ПЦР пониженной точности получена библиотека случайных мутантов, из которой отобраны неактивные формы фермента с помощью крупномасштабного колориметрического анализа. Отобрано 25 мутантных вариантов, 12 из которых исключены из дальнейших экспериментов, так как образовывали тельца включения. Оставшиеся 13 мутантов, синтезирующихся в растворимой форме, использованы для количественной оценки ферментативной активности и секвенирования. Активность мутантов W15R, C19Y, R22H/K83E, P61S, S73P, S109P и Q112R составила <1% активности немутантного фермента. Эти мутанты рассмотрены как «неактивные мутанты», тогда как мутанты K83E, Q102R и L147F, сохранившие значительную часть активности, выделены в группу «частично инактивированных мутантов». Эксперименты по молекулярномумоделированию показали, что мутации, приводящие к инактивации фермента, располагались непосредственно в субстратсвязывающем кармане или около него, тогда как мутации, приводящие к частичной инактивации, располагались на отдалении от обоих субстратов. Роль остатка S73 в ферменте определена с помощью сайтнаправленного мутагенеза. Результат свидетельствует о том, что скрининг неактивных точечных мутантов из библиотеки случайных мутантов – это эффективный подход к идентификации функциональных остатков в ферменте.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи:

captcha