Бактериальная продукция и ренатурация из телец включения «слабого» токсина, белка с высоким содержанием дисульфидных связей

Аннотация

Экспрессирован ген «слабого» токсина из яда кобры Naja kaouthia. «Слабый» токсин является специфичным ингибитором никотинового ацетилхолинового рецептора, однако механизмы взаимодействия подобных нейротоксинов с рецептором на данный момент остаются неизвестными. Для бактериальной продукции «слабого» токсина из яда кобры N. kaouthia опробованы системы, разработанные ранее для нейротоксина II из яда кобры N. oxiana. Созданы конструкции для цитоплазматической продукции «слабого» токсина из яда кобры N. kaouthia в виде слитной полипептидной цепи с тиоредоксином и для секреции с лидерным пептидом STII. Однако получить «слабый» токсин в миллиграммовых количествах удалось только в составе цитоплазматических телец включения. Опробованы различные подходы для ренатурации токсина и проведен поиск условий оптимизации выхода целевого белка в процессе ренатурации. Полученный белок охарактеризован методами масс-спектроскопии, КД- и ЯМР-спектроскопии. Эксперименты по конкурентному ингибированию связывания [¹²⁵I]α-бунгаротоксина с мембранами электрического органа ската Torpedo californica, содержащими никотиновый ацетилхолиновый рецептор мышечного типа (α1₂β1γδ), показали наличие биологической активности рекомбинантного «слабого» токсина, близкой к активности природного токсина (IC₅₀ 4,3 ± 0,3 и 3,0 ± 0,5 мкМ соответственно). Взаимодействие рекомбинантного токсина с нейрональным никотиновым ацетилхолиновым рецептором человека α7 типа, трансфецированным в клеточной линии GH₄C₁, также показало наличие активности, близкой к таковой природного токсина (IC₅₀ 31 ± 5 и 14,8 ± 1,3 мкМ соответственно). Разработанная бактериальная система продукции «слабого» токсина из яда кобры N. kaouthia позволила получить ¹⁵N-меченный аналог «слабого» токсина.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: