Структурно-функциональный анализ комплексов мутантных РНК-зависимых РНК-полимераз с VPg

Аннотация

Репликация генома вируса ящура полностью зависит от активности кодируемой вирусом РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp). Четыре мутантных RdRp вируса ящура выделены из фракции частиц вируса, обработанного рибавирином. Два мутантных фермента несли одиночные замены (L123F и T381A) и два – двойные (T291I/T381I и L123F/F244L). Мутантные белки экспрессировали в Escherichia coli и очищали металл-аффинной хроматографией. Для определения полимеразной активности использовали ПЦР в реальном времени с обратной транскриптазой в комбинации с системой РНК репликации in vitro с применением геномной РНК VPg в качестве праймеров и матрицы. Мутантный фермент L123F продемонстрировал 0,6-кратное уменьшение (p < 0,001) полимеразной активности в сравнении с RdRp дикого типа, в то время как активность L123F/F244L и T381A не проявилась. Против ожидания, активность T291I/T381I возросла в 0,7 раза (p < 0,001) по сравнению с диким типом. Для изучения структурно-функциональных отношений RdRp все структуры комплексов RdRp–РНК-матрица–праймер получили гомологичным моделированием и молекулярным докингом. Ориентацию VPg1 в комплексах RdRp–VPg1 определяли и анализировали при помощи математических методов. Показано, что ориентация VPg после связывания с полимеразой определяет каталитическую активность RdRp вируса ящура, что предлагает основу для рационального подхода к созданию новых антивирусных препаратов.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: