Связывание АТР и его производных селенофосфатсинтетазой из Escherichia coli

Аннотация

Селенофосфатсинтетазы (СФС) были получены из различных организмов. СФС из E. coli – АТР-зависимый фермент, молекула которого содержит на C-конце линейную, обогащенную глицином консервативную последовательность Уокера. Получены три мутантные формы СФС из E. сoli, молекулы которых укорочены со стороны C-концов и содержат 332 (СФС₃₃₂), 262 (СФС₂₆₂) и 238 (СФС₂₃₈) N-концевых аминокислотных остатка («укороченные» мутантные формы фермента). СФС₂₆₂ и СФС₃₃₂ были экстрагированы из клеток-продуцентов и очищены до гомогенного состояния. Препарат СФС₂₃₈ был солюбилизирован и получен высокоочищенным. Нами установлено, что ТНФ-АТР, флуоресцентное производное АТФ, может быть использовано в качестве структурного зонда для АТР-связывающих участков СФС. СФС «дикого» типа и СФС₃₃₂ содержат по два участка связывания ТНФ-АТР на молекулу белка, тогда как СФС₂₃₈ – только один. Методом гель-фильтрации в условиях ЖХВД было показано, что при насыщении СФС «дикого» типа связывает 2 моль Mn[¹⁴C]ATP на 1 моль белка, а стехиометрия связывания для СФС₃₃₂, СФС₂₆₂ и СФС₂₃₈ составляла 2, 1,6 и 1 соответственно. По сравнению с СФС дикого типа, неактивный мутант C17S сохраняет примерно 1/3 ТНФ-АТР-связывающей активности и может конвертировать 12% АТР в ADP в процессе АТРазной реакции в отсутствие селенида. Вероятно, C-концевая часть молекулы СФС обеспечивает около 2/3 ее ТНФ-АТР-связывающей активности, а у СФС₂₃₈ сохраняется только один из двух его АТР-связывающих участков.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: