Электрон-транспортные свойства и функциональная компетентность цитохрома b₅ в составе сшитого белка Hmwb₅-EGFP в реакциях с участием цитохрома Р450 3А4^*

Аннотация

Исследованы молекулярные механизмы межбелковых взаимодействий цитохрома Р450 3А4 (CYP3A4) с цитохромом b5, находящимся в составе сшитого рекомбинантного белка Hmwb₅-EGFP, состоящего из полноразмерного цитохрома b5 (функциональный модуль) и мутантной формы зеленого флуоресцирующего белка EGFP (реперный модуль). Показано, что цитохром b5 в рамках сшитого белка Hmwb₅-EGFP способен восстанавливаться NADPH-цитохром Р450-редуктазой в присутствии NADPH, причем скорость восстановления определяется ионной силой раствора, свидетельствуя о том, что реперный модуль не препятствует взаимодействию флавопротеида и гемопротеида. Взаимодействие цитохрома Р450 3А4 и Hmwb₅-EGFP оценено по смещению спинового равновесия цитохрома Р450 3А4 в пользу высоко-спиновой формы в присутствии Hmwb₅-EGFP, а также по изменению анизотропии флуоресценции EGFP в рамках Hmwb₅-EGFP в присутствии CYP3A4. Таким образом, конструирование химерного белка Hmwb₅-EGFP дает независимый метод определения К_d цитохрома Р450 и цитохрома b5, менее чувствительный к воздействию факторов среды, по сравнению со спектрофотометрическим титрованием, применяемым ранее. На основании реконструкции активности цитохрома Р450 3А4 в реакции 6β-гидроксилирования тестостерона в присутствии Hmwb₅-EGFP показано активирующее действие Hmwb₅-EGFP на реакцию гидроксилирования. Использование других сшитых белков, включающих цитохром b5 или его гидрофильный домен для реконструкции гидроксилазной системы цитохрома Р450 3А4, позволило сделать вывод о том, что гидрофобный домен цитохрома b5 участвует не только в реализации взаимодействия гемопротеидов, но и в переносе электронов с цитохрома b5 на цитохром Р450.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: