Роль структурных особенностей реакционной петли серпина в ингибировании дуоденазы на примере взаимодействия с мутантными формами антихимотрипсина^*

Аннотация

Для выяснения причин субстратной избирательности дуоденазы и выявления структурных факторов, определяющих ее специфичность к тому или иному субстрату (ингибитору), было исследовано взаимодействие дуоденазы с рядом мутантных форм антихимотрипсина. Дуоденаза взаимодействует с рекомбинантным антихимотрипсином и его Р1-вариантами с образованием ковалентного соединения фермент–ингибитор и стехиометрией реакции (SI), равной 1,2. Измерены константы скоростей ассоциации дуоденазы с рекомбинантным антихимотрипсином и его вариантами. Введены понятия индексов конформационной и первичной специфичности протеаз (Ics и Ips соответственно), отношение которых (Ics/Ips) характеризует соотношение конформационной и первичной специфичности для определенного фермента. В случае дуоденазы и катепсина G значение Ics/Ips >1, что свидетельствует о доминирующей роли конформационной специфичности у этих протеаз. В случае трипсина и химотрипсина Ics/Ips <1, что характеризует их как ферменты, более чувствительные к природе Р-1 остатка, чем к конформационным свойствам субстрата. Исследовано взаимодействие дуоденазы с химерными вариантами rACT, содержащими вставку различной длины из реакционной петли антитрипсина (АТ), более эффективно ингибирующего дуоденазу, чем АСТ (rАСТ Р2-Р3′, rАСТ Р3-Р4′, rАСТ Р4-Р3′ и rАСТ Р6-Р4′). Хотя по сравнению с АСТ, АТ является более эффективным ингибитором дуоденазы, ингибиторные свойства исследованных химерных форм АСТ существенно снижены. Методом SDS-электрофореза показано, что при T = 25° и в условиях молярного избытка ингибитора над субстратом ([I]>>[E]) взаимодействие таких химерных вариантов rАСТ протекает по типу обратимого ингибирования. Вычислены константы ингибирования (Кi) дуоденазы химерными формами rACT. При Т = 37° происходило образование ковалентного комплекса серпин-дуоденаза для всех исследованных химерных вариантов rACT за исключением rАСТ Р6-Р4′. Обсуждаются вероятные причины снижения ингибирующих свойств исследованных химерных вариантов АСТ.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: