Определение ДНК-полимеразной и нуклеазной активностей ДНК-зависимых полимераз с использованием флуоресцентной детекции в режиме реального времени

Аннотация

Предложен новый способ оценки активности ферментов-полимераз с помощью флуоресцентной детекции в ходе изотермической реакции. Метод позволяет одновременно определять ДНК-зависимую ДНК-полимеразную и 5′-3′-экзонуклеазную активности с помощью амплификаторов с оптическим модулем для детекции флуоресценции в режиме реального времени. Проведено сравнение различных комбинаций праймер–матрица, используемых в качестве субстрата для полимераз. Удлинение праймера (полимеразная реакция) детектируется по изменению флуоресценции красителя SYBR Green I при связывании с дцДНК, образующейся в ходе реакции, нуклеазные активности – по изменению флуоресценции в результате расщепления зонда, содержащего репортерный флуорофор и гаситель флуоресценции и предварительно гибридизованного с одноцепочечным участком матрицы. Показана возможность использования метода для определения относительной активности препаратов ДНК-полимераз, для оценки температурно-временных параметров диссоциации комплексов полимеразы и специфических антител к ее активному центру и анализа влияния ингибиторов и активаторов различной природы на скорость реакций полимеризации и 5′-3′-экзонуклеазного расщепления полимеразой дцДНК. Метод также может использоваться для оценки эндонуклеазной активности ДНК-полимераз.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: