Псевдо-β-глюкозидаза Arabidopsis thaliana: корректирование методом сайт-специфического мутагенеза, гетерологичная экспрессия, очистка и характеристика^*

Аннотация

Кодирующая предсказанную последовательность зрелого изоэнзима β-глюкозидазы кДНК была синтезирована с использованием в качестве матрицы геномной ДНК Arabidopsis thaliana, так как соответствующий ген, At2g25630, не содержит интрона. С помощью сайт-специфического мутагенеза незрелый стоп-кодон, содержащийся внутри гена, был конвертирован в смысловой кодон. Последовательности нативной кДНК и кДНК мутанта были раздельно клонированы в вектор pPICZαB и экспрессированы в Pichia pastoris. Показано, что только клетки, трансформированные конструкцией, содержащей кДНК мутанта, могли продуцировать активный белок. Проведена хроматографическая очистка до кажущейся гомогенности рекомбинантного изозима β-глюкозидазы, в который была введена мутация. Определена молекулярная масса белка составившая ~60 кДа. Показано, что очищенная рекомбинантная β-глюкозидаза активна в отношении пара-/орто-нитрофенил-β-глюкопиранозида (п-/о-НФГ) и метилумбеллиферил-β-D-глюкопиранозида (4-МУГ) с K_М, равными 1,9, 2,1, 0,78 мМ, и k_cat, равными 114, 106 и 327 нкат/мг соответственно. Она также в различной степени была активна по отношению к пара-/орто-нитрофенил-β-D-фукопиранозидам (п-/о-НФФ), амигдалину, пруназину, целлобиозе, гентиобиозе и силицину. Установлено, что активность фермента, измеренная в присутствии субстратов п-НФГ, о-НФГ и 4-МУГ, полностью подавляется глюконолактоном и p-нитрофенил-1-тио-β-D-глюкопиранозидом. Показано, что фермент не чувствителен к глюкозе как ингибитору. Рассмотрена каталитическая роль нуклеофильной глутаминовой кислоты в мотиве YITENG β-глюкозидаз и рекомбинантного фермента мутанта.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи: